徐曉慶等

摘要

[目的]測定15種中草藥提取物抗TMV的活性。[方法]利用半葉枯斑法，初篩測定15種中草藥對TMV鈍化作用，復(fù)篩測定其對TMV初侵染和復(fù)制增殖作用。[結(jié)果]商陸、大黃、板藍根、金銀花4種中草藥表現(xiàn)出明顯的TMV體外鈍化作用，其鈍化抑制率均在50%以上；復(fù)篩測定4種中草藥抗TMV初侵染和復(fù)制增殖活性，大黃表現(xiàn)出較好的活性，且與其他3種中草藥相比差異顯著。盆栽試驗表明，植物提取液（大黃）在100倍液下，噴霧加灌根的施藥方式對煙草病毒病的防效最好，達49.00%，優(yōu)于對照藥劑20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑。[結(jié)論]15種中草藥中大黃具有較優(yōu)的抗TMV活性，值得進一步研究。

關(guān)鍵詞中草藥；煙草花葉病毒；心葉煙；曼陀羅

中圖分類號S567文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）06-01691-03

Abstract[Objective] The aim was to study the active determination of the extracts of 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV. [Method] Using half leaf blight spot method， 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV in vitro was determined in the experiment of initial screening， after screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV. [Result] Four kinds of Chinese herbal medicine， Phytolacca acinosa Roxb.， Rheum palmatum L.， Isatis tinctoria， Lonicera japonica Thunb.， had an obvious inactivation on TMV in vitro， and the inhibition rate was more than 50%. After screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV， Rheum palmatum L. showed better activity. It had a significant difference compared with the other three kinds of Chinese traditional medicine. In the field plot trials， the extract of Rheum palmatum L.（100 times， spraying+pouring ）was better than Moroxydine+Cupric acetate， W.P.（20%） and had the best inhibition rate（49.00%）. [Conclusion] Rheum palmatum L. had the best activity against TMV， and was worth further studying.

Key words Chinese traditional medicine； TMV； Nicotiana glutinosa L.； Datura stramonium L.

植物病毒病的防治相對于病（真菌、細菌）、蟲、草等的防治較為困難，全世界每年因其造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)百億元，然而成為商品的抗植物病毒劑較少[1-5]。面對植物病毒病發(fā)生日益嚴重，抗植物病毒藥劑依然匱乏的局面，繼續(xù)深入開展抗植物病毒劑的研究具有十分重要的意義。

我國作為植物源農(nóng)藥研究和使用最早的國家，其抗病毒問題的研究主要是伴隨著中醫(yī)和中草藥的發(fā)展而出現(xiàn)的。很多具有較好抗病毒（動物）活性的中草藥對于抗植物病毒活性的研究值得借鑒。基于此，筆者以煙草花葉病毒（TMV）為研究對象，將15種常見的抗病毒中草藥的抗TMV活性進行比較研究[6-8]。另外，為保證活性測定的準確性，選擇心葉煙和曼陀羅2種枯斑寄主作為活性指示材料，在對15種中草藥抗TMV體外鈍化試驗后，選擇具有較優(yōu)抗病毒活性的中草藥進行復(fù)篩，并測定其在普通煙上的抗TMV活性，以期為我國植物源農(nóng)藥的研究與開發(fā)積累資料。

1 材料與方法

1.1 枯斑寄主

心葉煙（Nicotiana glutinosa L.）、曼陀羅（Datura stramonium L.）。將心葉煙或曼陀羅種子與一定量基質(zhì)混勻后均勻灑在裝有基質(zhì)的育苗盤中，澆水適量，置于適宜條件下（溫度22 ℃，光照16 h/d，濕度60%）培養(yǎng)，當幼苗長至4～6片真葉時供試[9]。

1.2供試植物

15種中草藥全部購自黑龍江省醫(yī)藥公司，經(jīng)相關(guān)專家鑒定確認后，50 ℃烘干后，粉碎，過40目篩，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3供試毒源

煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus， TMV）由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)部植物病理研究所提供。參照王人元[10]的方法對其提純，提純后的病毒經(jīng)紫外掃描呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20），病毒接種液用PBS緩沖液定容為20 μg/ml。

1.4植物提取物的制備

稱取各植物材料50 g，5倍量95%乙醇回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液，過濾，減壓濃縮至膏狀，稱重后用少量二甲亞砜（DMSO）溶解后配成10 mg/ml的水溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5試驗方法

1.5.1

對TMV體外鈍化作用測定。采用半葉枯斑法[11]測定。選取生長旺盛的4～6葉期心葉煙或曼陀羅，左半葉接種供試藥劑與病毒等體積混合液（用植物提取液50倍液鈍化病毒），右半葉接種蒸餾水與病毒等體積混合液（對照）。試驗重復(fù)3次，5～7 d后計算枯斑數(shù)，枯斑抑制率按照“1.7”中公式計算。

1.5.2

對TMV初侵染和復(fù)制增殖作用測定。

采用半葉枯斑法[11]測定。選取生長旺盛的4～6葉期心葉煙或曼陀羅，初侵染試驗中先在供試植物左半葉施藥，間隔5 min后，再全葉接種病毒；復(fù)制增殖試驗中先全葉接種病毒，間隔5 min后，再在供試植物左半葉施藥。中草藥提取液供試濃度為50倍水稀釋液，嗎啉胍·乙銅施藥濃度為400倍液，病毒接種濃度為10 mg/L。試驗重復(fù)3次，5～7 d后計算枯斑數(shù)，按“1.7”中公式計算枯斑抑制率。

1.6盆栽試驗

試驗設(shè)大黃提取液100倍液和200倍液2個劑量，噴霧、灌根、噴霧加灌根3種處理方法，以20%的嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑400倍液常量噴霧為對照，并設(shè)清水對照，共計8個處理，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)10株煙苗；自發(fā)病初期開始施藥，每隔7 d施藥1次，共3次。3次施藥7 d后調(diào)查病情，統(tǒng)計防效。病情分級標準：0級：全株無?。?級：心葉脈明或輕微花葉，植株無明顯矮化；3級：1/3葉片花葉但不變形，或植株矮化為正常株高的3/4；5級：1/3～1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，或植株矮化為正常株高的2/3～3/4；7級：1/2～2/3葉片花葉、變形或主側(cè)脈壞死，或植株矮化為正常株高的1/2～2/3以上；9級：全株葉片花葉、嚴重變形或壞死，或植株矮化為正常株高的1/2以上[12]。

3 小結(jié)與討論

（1）該研究對15種中草藥樣品進行了抗TMV活性研究。在對TMV體外鈍化作用方面，商陸、大黃、板藍根、金銀花4種中草藥表現(xiàn)出較好的活性，在抗TMV初侵染和復(fù)制增殖方面，大黃表現(xiàn)出較好的活性。盆栽試驗中植物提取液（大黃）在100倍液下，噴霧加灌根的施藥方式對煙草病毒病的防效最好，達49.00%，優(yōu)于對照藥劑20%嗎啉胍·乙銅可濕性粉劑。

（2）該研究采用心葉煙和曼陀羅2種指示植物作為枯斑寄主，主要是考慮到接種病毒的不確定因素很多，接種時每次摩擦的輕重、接種后到對接種葉片進行水洗之前的時間、水洗時間等方面都影響到病斑數(shù)的多少；同時由于心葉煙和曼陀羅本身對TMV的抗性也不相同，采用2種枯斑寄主會大大增加試驗結(jié)果的可靠性。

（3）室內(nèi)盆栽試驗表明，植物提取液（大黃）以噴霧加灌根施藥效果最好，由此初步推測植物提取液（大黃）可能具有一定的內(nèi)吸作用。這可能與植物提取液（大黃）中含有大量的小分子抗病毒物質(zhì)有關(guān)，而小分子物質(zhì)來源于植物，易被植物吸收。關(guān)于植物提取液（其他類中草藥）是否普遍都具有內(nèi)吸作用還有待于進一步深入研究。

（4）該研究以煙草花葉病毒作為基本防治對象，實際大田作物發(fā)病時往往是多種病毒的混合感染，所以用煙草花葉病毒篩選出的抗病毒中草藥是否對其他病毒也具有較好的防效還值得進一步研究。

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