袁群芳

摘 要：牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis， bTB）是由牛型分枝桿菌（Mycobacterium bovis）感染引起的一種慢性消耗性人獸共患傳染病，其中奶牛為最易感動物。伴隨我國奶業(yè)的快速發(fā)展，奶牛結(jié)核病近年來蔓延全國，不僅阻礙著我國奶業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且嚴重威脅食品安全和公共衛(wèi)生。近年發(fā)展起來的IFN-γ體外釋放法為結(jié)核病的診斷提供了新的方向。本研究利用融合蛋白RCE刺激的IFN-γ體外釋放法試驗對某奶牛場59頭奶牛進行檢測，確定被檢奶牛是否感染結(jié)核分枝桿菌。共檢出陽性牛44頭，陰性牛15頭。與結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應相比較，其敏感性為75.6%，特異性為26.1%。本試驗為牛結(jié)核病IFN-γ診斷試劑盒的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞：牛結(jié)核病；牛型分枝桿菌；IFN-γ；雙抗體夾心ELISA方法；結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應；RCE；融合蛋白

1前言：IFN-γ體外釋放法是將結(jié)核菌特異性加入被檢測的牛的血液或者含有外周血單核細胞的培養(yǎng)基中進行孵化，如果被檢測的牛受到過結(jié)核分枝桿菌的感染，那么被結(jié)核菌激活的記憶T淋巴細胞將會對這些特異性抗原產(chǎn)生反應，釋放出大量IFN-γ（γ-干擾素），通過檢測γ-干擾素的釋放水平來判斷是否存在結(jié)核菌感染。

1.1 牛結(jié)核病的流行現(xiàn)狀及危害

牛結(jié)核?。╞ovine tuberculosis， bTB）主要是由牛結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病。牛結(jié)核病在各國均有發(fā)生，因為容易傳染，并通過牛奶傳染給人和牛，危害性很大，被國際動物衛(wèi)生組織（OIE）定為B類動物傳染病，我國將其列為二類動物疫病。牛結(jié)核病為慢性消耗性疾病，感染的牛通常會在一定時間后表現(xiàn)臨床癥狀，并將病菌傳播給群內(nèi)其他動物。如果不早檢測，易造成牛群大批感染，感染牛日漸消瘦，產(chǎn)奶量降低，降低奶牛的經(jīng)濟價值，而且成為人結(jié)核病的傳染源。我國結(jié)核病的研究比較滯后，雖然政府加大防疫監(jiān)管力度，但近年來奶牛結(jié)核病還時有發(fā)生。因此非常有必要加強牛結(jié)核病的研究。

1.2 病原

Koch在1882年發(fā)現(xiàn)牛的結(jié)核病的病原為牛分枝桿菌。牛分枝桿菌屬于放線菌目分支桿菌屬，該菌為專性需氧菌，是一種細長而稍彎曲桿菌，無鞭毛，無運動性，不形成芽胞，無莢膜，不產(chǎn)生內(nèi)外毒素，革蘭氏染色陽性。分支桿菌含有較厚的蠟脂，因此對外界環(huán)境抵抗力較強。陰濕處可生存5個月以上，陽光曝曬2 h，700 mg/L-750 mg/L酒清接觸2 min，60℃溫度持續(xù)10 ～30 min，85℃持續(xù)5 min或90 ℃持續(xù)1 min均可殺死。對50 mg/L石碳酸、40 g/L氫氧化鈉和30 mg/L福爾馬林等消毒劑敏感[3]。

1.3牛結(jié)核病診斷方法的研究

由于目前牛結(jié)核病的防治沒有特效的疫苗可以預防，世界各國控制該病主要采用的是“檢疫-撲殺”的方法處理此病。因此牛結(jié)核病的診斷方法在該病的控制中起著關(guān)鍵的作用。根據(jù)感染牛結(jié)核分枝桿菌在機體內(nèi)有一定的病理變化，但臨床癥狀很不明顯，因此僅憑癥狀難以診斷該病。必須用一些特殊的診斷方法進行診斷，這不僅有利于確診，更可查出隱性病牛。目前，國內(nèi)外用于診斷牛結(jié)核病的檢測方法，一般用以下4類：一是細菌學檢查方法；二是免疫學方法檢測結(jié)核菌的特異性抗體；三是分子生物學檢測方法；四是細胞因子及細胞因子受體檢測法，如IFN-γ試驗。

2 研究目的與意義

由于目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有效藥物與疫苗用于牛結(jié)核病的防治，根除牛結(jié)核病主要采取檢疫與撲殺陽性牛的國際通用政策。由于結(jié)核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的非特異性抗原組份，檢測時容易出現(xiàn)假陽性，因此，結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應的特異性受到質(zhì)疑。為了提高檢測的靈敏度，人們建立了使用特異性抗原刺激產(chǎn)生IFN-γ檢測牛結(jié)核病的方法。在國外，IFN-γ體外釋放檢測方法的使用曾使許多國家在牛結(jié)核病的防控上節(jié)省了大部分的開支，因此在我國推廣該診斷方法是十分迫切與急需的。通過大量的臨床診斷試驗確定其敏感性與特異性，對該方法的推廣和IFN-γ檢測試劑盒的研制具有重要意義。但目前該法在國內(nèi)與皮內(nèi)變態(tài)反應開展的對比試驗極少，其敏感性和特異性還需大量數(shù)據(jù)支持。本研究利用原核表達的融合蛋白RV3872- ESAT-6-CFP-10（RCE）刺激全血，利用雙抗體夾心ELISA法檢測刺激的全血上清中IFN-γ的含量，并以此診斷牛結(jié)核病。同時與皮試方法做比較，為牛結(jié)核病IFN-γ檢測試劑盒的研制提供數(shù)據(jù)支撐。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 實驗動物 奶牛：某地區(qū)59頭成年奶牛。

3.1.2 主要試劑與儀器

RCE蛋白（實驗室自制），抗牛IFN-γ單克隆抗體，兔源抗IFN-γ多克隆抗體，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗；10 mL注射器，肝素鈉抗凝管，1.5 mL離心管， 96孔微孔板，可調(diào)微量移液器，酶標儀。

3.1.3 ELISA緩沖液的配制

包被液（25 mmol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）：Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，ddH2O 加至1 000 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

洗滌液（0.05% Tween-20 PBS，pH 7.4）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，Tween-20 0.5 mL，ddH2O加至1 000 mL。

封閉液：5 g脫脂奶粉溶于100 mL洗滌液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

底物緩沖液（磷酸鹽·檸檬酸鹽緩沖液，pH 5.0）：0.2 mol/L Na2HPO4 25.7 mL，0.1 mol/L檸檬酸24.3 mL，ddH2O 50 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

TMB母液：0.29 TMB干粉溶于l00 mL無水乙醇中配制而成，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

底物液（TMB）（新鮮配制）：TMB母液用底物緩沖液按l∶20的比例稀釋，每毫升底物液加入0.2 μL 30% H2O2。

終止液（0.25% HF）：HF（40% ） 625 μL，ddH2O 100 mL。

3.2 方法

3.2.1 牛結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應

3.2.1.1 注射

保定好牛只，在頸側(cè)中部上1/3處剪毛，直徑約l0 cm，用卡尺測量術(shù)部中夾皮皺厚度，作好記錄。術(shù)部用酒精棉球消毒，皮內(nèi)注入0.1 mL牛提純結(jié)核菌素。注射后局部出現(xiàn)小泡為正確。

3.2.1.2 觀察并記錄結(jié)果

注射后，在第72 h進行觀察，注意局部有無熱、痛、腫脹等炎癥反應，并以游標卡尺測量術(shù)部腫脹面皮皺厚度，作好詳細記錄。若皮厚差大于等于4 mm，則為結(jié)核菌素陽性牛，記為“+”；若皮厚差小于2 mm，則為結(jié)核菌素陰性牛，記為“-”；若在兩者之間，為可疑牛，記為“？”。

3.2.2 采血

從以上受試牛中選取皮試結(jié)果陽性牛50頭與皮試結(jié)果陰性牛50頭。頸靜脈或尾靜脈無菌采血，每頭牛10 mL，立即注入5 mL肝素鈉抗凝管。4 ℃保存。24 h內(nèi)進行培養(yǎng)。

3.2.3 分別刺激血樣

將血樣按1 mL/孔分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。于第1個孔中加入40 μgRCE，作為檢測孔；于第2個孔中加入10 μLPBS，作為陰性對照。將孔中各試劑與血液輕輕混合，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。次日收集上層血清進行夾心ELISA檢測。

3.2.4 牛IFN-γ雙抗體夾心ELISA方法

3.2.4.1 包被：抗牛IFN-γ單克隆抗體用包被液 1∶5000稀釋，然后進行包被，用于檢測抗原。每孔100 μL，置4 ℃過夜（至少8 h）；

3.2.4.2 洗板：取出預包被的酶標板，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，每次300 μL/孔，每次靜置3 min倒掉，最后一次拍干（洗板機通常洗板4次，靜置1 min，每次200 μL/孔）；

3.2.4.3 封閉：每孔加入200 μL封閉液封閉，需4 ℃過夜，或放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h；

3.2.4.4 洗板：方法同上。

3.2.4.5 加抗原（提純BovIFN-γ或全血刺激產(chǎn)物） ：加入刺激后的血清，100 μL/孔，37 ℃作用45 min；

3.2.4.6 加夾心的兔源抗IFN-γ多克隆抗體：加入稀釋至最佳濃度的多克隆抗體，100 μL/孔（這里使用的是兔源抗IFN-γ多克隆抗體，用洗滌液1∶1600稀釋）。37 ℃作用1 h；

3.2.4.7 洗板：方法同上。

3.2.4.8加二抗：加入1∶10000倍稀釋的羊抗兔HRP-IgG二抗，100 μL/孔，37 ℃作用30 min；

3.2.4.9 洗板。每孔加入300 μL，洗滌5次，最后一次拍干。

值得注意的是，因二抗不易洗凈，而未洗凈的二抗干擾實驗結(jié)果，可能導致假陽性增多或陽性值偏高。所以洗板時應多洗一次，每次拍板時都要拍得較干。

3.2.4.10 顯色：每孔加底物液A、B各50 μL，混勻，室溫避光顯色10 min；每孔加50 μL終止液終止反應。

3.2.4.11 讀數(shù)：測各孔在630 nm處的吸光度（OD630 nm）。

3.2.5 結(jié)果判定：ODRCE-OD陰性對照≥0.1為陽性；否則為陰性。

4 結(jié)果與分析

4.1 59頭奶牛檢測結(jié)果

對某奶牛場臨床檢測的奶牛中，采集單次皮內(nèi)變態(tài)反應陽性牛（37頭）和陰性牛（22頭）全血用于抗原特異性IFN-γ試驗檢測牛結(jié)核病。用RCE和PBS刺激全血，16 h后用雙抗體夾心ELISA方法檢測上清中IFN-γ含量，以此判斷是否感染牛結(jié)核分枝桿菌。利用IFN-γ方法共檢出RCE（見表1）。

4.2 兩種方法的符合率、敏感性和特異性比較

本實驗分別用結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗（TST）與牛結(jié)核病IFN-γ試驗檢測了59份奶牛樣本，比較兩種方法檢測的結(jié)果。其中37頭皮內(nèi)變態(tài)反應陽性牛中檢出IFN-γ牛型結(jié)核陽性28頭，陰性9頭；22頭皮內(nèi)變態(tài)反應陰性牛中檢出IFN-γ牛型結(jié)核陽性16頭，陰性6頭。以結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗結(jié)果為標準，IFN-γ體外釋放法的敏感性為75.6%，特異性為26.1%，總符合率為54.5%。結(jié)果見表2。

5 討論

皮內(nèi)變態(tài)反應，由于存在交叉反應，時常發(fā)生非特異性的反應，造成誤判；同時該法敏感性較低，經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性和假陰性反應，故OIE認為僅用單一的結(jié)核菌素試驗進行根除此病很難，且皮內(nèi)變態(tài)反應由于受遲發(fā)型變態(tài)反應的影響，在30 天內(nèi)不能進行復檢，造成了病原的擴散和疫情處置的延誤。

近年來發(fā)展的抗原特異性IFN-γ試驗用于牛結(jié)核病的診斷因其敏感性和特異性較強，檢出時間短而備受關(guān)注。另外，IFN-γ試驗由于減少了結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗中操作和解釋上的主觀性，使結(jié)果更為客觀、可靠。有些對牛群進行卡介苗免疫的國家或地區(qū)，由于卡介苗中含有與牛型結(jié)核菌素相同的抗原成分，因而結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應并不能夠鑒別免疫動物與感染動物。而此法能夠避免使許多非結(jié)核牛被誤判為結(jié)核牛，造成不應有的損失。與結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗相比， IFN-γ測定法不僅簡單、快速，靈敏度高，而且能鑒別出早期感染牛分枝桿菌的牛，從而降低了傳染的風險。所以IFN-γ測定法可用于對檢出陽性和可疑牛進行復檢。

RCE是牛結(jié)核分枝桿菌特異性抗原，理論上講，用RCE刺激全血的IFN-γ體外釋放法檢測牛結(jié)核病時，其敏感性和特異性很好。而本實驗中，IFN-γ試驗共檢出陽性牛44頭，與TST 方法比較符合率偏低，可能的原因主要有以下幾個方面：第一，因TST操作有著本身固有的缺陷，TST試驗引起的非特異性反應現(xiàn)象嚴重，如牛分枝桿菌感染初期、封閉型結(jié)核、非典型分枝桿菌干擾等；第二，TST的操作和結(jié)果判斷容易摻雜操作者的主觀因素，不同的操作者之間經(jīng)常存在明顯的誤差，在一定程度上影響了IFN-γ試驗與TST的符合率；第三，機體在使用藥物治療或免疫抑制時，可能引起TST假陰性結(jié)果；第四，本實驗涉及的牛場結(jié)核陽性率比較高，早中晚期感染牛均存在，而TST對晚期感染牛的敏感性很低，而IFN-γ不受此影響，故影響了陰性符合率。

我們相信，通過對RCE融合蛋白刺激條件的不斷改良，對夾心ELISA反應條件的進一步優(yōu)化，以及對該方法操作步驟的標準化，將提高IFN-γ體外釋放法檢測牛結(jié)核病的敏感性和特異性。而開展更為廣泛的田間試驗，將使該方法在我國牛結(jié)核病診斷和流行病學調(diào)查中的應用將成為可能，尤其在與TST試驗共同檢測，將提高檢測的準確性，更適用于水牛結(jié)核病的確診和對陽性牛的撲殺，有利于結(jié)核病?！皺z疫-撲殺”策略的開展。（編輯：何芳）