劉蘇君，高永安，張陳量，金俊杰，涂宜強，荀飛瓊，2，白 宇*

(1.溫州科技職業(yè)學院，浙江溫州325006;2.溫州歐斯達康生物公司)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失［1-2］。

NDV 為一種有囊膜、單股不分節(jié)段的負鏈RNA病毒。NDV 基因組全長約15 186 bp，編碼6 個主要病毒結(jié)構(gòu)蛋白:核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素－神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)［3］。其中，NP 蛋白是組成病毒核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與L 蛋白、P 蛋白包裹病毒基因組RNA 形成螺旋狀的核糖殼，在轉(zhuǎn)錄和復制過程中充當模板，NP 蛋白N 末端2/3 與RNA 直接結(jié)合，并作為核衣殼組裝所必須的區(qū)域［4］。NP蛋白還具有較高的免疫原性，可能與其刺激機體產(chǎn)生免疫機能有關(guān)［5-6］。

本試驗旨在克隆NDV LaSota 毒株NP 基因，利用原核表達系統(tǒng)獲得純化的NP 蛋白，為進一步研究其生物學特性和制備相應(yīng)抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體與菌株 NDV 毒株為雞新城疫活疫苗(LaSota 株)，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

pBluscript ⅡKS(+ /－)和pET-28a 載體由溫州科技職業(yè)學院動物科學系動物病毒研究室保存，感受態(tài)細胞E coli DH5α 和BL21(DE3)工程菌購自某生物工程(大連)有限公司。

1.2 工具酶及主要試劑 RNA 酶抑制劑、PCR 反應(yīng)試劑、DNA Marker(DL2000、DLl5000)、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)、IPTG、限制性內(nèi)切酶(Eco R I，Xho I，Eco R V)購自某生物工程(大連)有限公司;DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自某生物工程(上海)股份有限公司;Ni-NTA 純化樹脂購自QIAGEN 公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 本試驗所用引物以Gene Bank 上公布的NDV LaSota 株基因組序列(基因序列號為AF077761)為參考序列，利用Primer 5.0 軟件進行設(shè)計，由某生物工程(上海)股份有限公司合成。

上游引物P1:

5'-CCGGAATTCATGTCTTCCGTATTTGA-3'

下游引物P2:

5'-CCGCTCGAGTCAATACCCCCAGTC-3'

為便于構(gòu)建表達載體，在上、下游引物5'端分別加入Eco R I 和Xho I 酶切位點(引物中下劃線部分)，并加3 個保護性堿基。

1.4 NDV RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 NDV LaSota 株疫苗病毒液150 μL，參照說明書用試劑盒提取病毒RNA。然后進行反轉(zhuǎn)錄，合成病毒cDNA。

反轉(zhuǎn)錄體系如下:先將RNA 22 μL:特異性下游引物1 μL;dNTP(2.5 mm)3 μL;DTT 3 μL;65℃5 min;冰水浴5 min;然后加入5 × FS Buffer 8 μL;RNase Inhibitor 1 μL;M-MLV 1 μL 37℃水浴2 h，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因的PCR 擴增與克隆 以反轉(zhuǎn)錄得到NDV LaSota 株NP 基因cDNA 為模板，利用特異引物進行PCR 擴增。

PCR 體系:5 ×primestar Buffer 10 μL;primestar 0.5 μL;dNTP(2.5 mm)4 μL;P1(上游引物)1.5 μL;P2(下游引物)1.5 μL;Template(cDNA)4 μL;dH2O 28.5 μL。

反應(yīng)條件:95℃預變性5 min，98℃變性10 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸1.5 min，反應(yīng)30 個循環(huán)后，72℃終延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR 產(chǎn)物進行核酸電泳鑒定。

NDV LaSota 株NP 基因克隆:將上述PCR 產(chǎn)物膠回收后與pBluscript ⅡKS(+ /－)載體16℃連接2 h。構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pBlue-NDV-NP。將pBlue-NDV-NP 轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH-5α 中并均勻涂在氨芐抗性的LB 平板上。經(jīng)IPTG 誘導，17 h 后挑取菌落中白色陽性菌落，37℃培養(yǎng)16 h。參照試劑盒說明書提取質(zhì)粒，將初步鑒定陽性質(zhì)粒送某生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.6 NDV NP 基因表達栽體的構(gòu)建與鑒定 經(jīng)酶切和測序鑒定的載體pBlue-NDV-NP 用Eco R I 和Xho I 進行雙酶切處理。膠回收試劑盒回收獲得NP基因。

pET-28a 載體用Eco R I 和Xho I 進行雙酶切處理，與回收獲得的NP 基因進行連接后，轉(zhuǎn)入DH-5α并均勻涂在含卡那霉素抗性的LB 平板上。重組質(zhì)粒pET-28a-NDV-NP 用Eco R I 、Xho I 酶切鑒定。鑒定正確后轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)用于表達。

1.7 重組質(zhì)粒的誘導表達和重組蛋白的可溶性分析 設(shè)置空載體pET-28a 為對照。用含卡那霉素的新鮮LB 液體培養(yǎng)基按1∶100 比例分別稀釋pET-28a-NDV-NP 與空載體pET-28a 菌液，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達0.6 時，用終濃度為1.0 mM/L IPTG 37℃誘導5h。取15 mL 后菌液，6000 g 離心10 min，去上清，加入結(jié)合緩沖液重懸沉淀。

經(jīng)超聲處理后，6000 g 離心分離上清與沉淀樣品，用于SDS-PAGE 檢測，確定重組蛋白是否為可溶性表達。

1.8 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析 將收集到的菌液4℃，12000 r/min 離心10 min 后收集沉淀，PBS重懸，加入等體積2 ×SDS 凝膠上樣緩沖液，煮沸5 min，作為SDS-PAGE 電泳上樣樣品。

按照分子克隆實驗指南方法進行SDS-PAGE 電泳［7］，濃縮膠5%，分離膠12%，恒壓120 V，同時以含空載體菌體和含重組陽性載體誘導前菌體為對照。電泳完畢后，取下凝膠，置于考馬斯亮蘭R250染色，脫色液脫色數(shù)次后分析蛋白的表達情況。

1.9 重組蛋白的純化與Western-blot 分析 取100 mL 誘導后的菌液，10000 g 4℃離心5 min，棄上清。將細菌沉淀中加入結(jié)合緩沖液重懸后。超聲破碎細胞，10000 g 離心20 min，收集上清。參照QIAGEN純化試劑盒說明進行蛋白純化，純化樣品進行SDSPAGE 檢測，檢測純化效果。

將SDS-PAGE 凝膠電泳蛋白條帶轉(zhuǎn)印到NC 膜上，用洗滌液PBST(含有0.05%吐溫20)洗膜3 次，每次3 min;然后加入抗His-tag 單抗為一抗(1∶2000稀釋)，室溫振蕩1 h;再用PBST 洗膜3 次，每次3 min;然后加入1∶5000 稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗鼠-抗體為二抗，室溫振蕩1.5～2 h;再用PBST 漂洗3 次，每次3 min;最后置于DAB 顯色液中顯色，待條帶清晰后迅速用dH2O 終止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV LaSota 株NP 基因的克隆和pBlue-NDVNP 構(gòu)建與酶切鑒定 詳見圖1、圖2。

圖1 NDV NP 基因PCR 擴增

圖2 重組質(zhì)粒pBlue-NDV-NP 的酶切鑒定

由圖1可見，RT-PCR 擴增得到NDV LaSota 株NP 基因，1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測結(jié)果顯示，獲得1470 bp 左右產(chǎn)物大小與預計大小相符目的片段。

由圖2可見，利用T4 DNA 連接酶將PCR 產(chǎn)物連接載體pBlue，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，小量提取質(zhì)粒后進行Xho I 單酶切和Xho I、Eco R I 雙酶切鑒定。

以上結(jié)果表明，成功構(gòu)建重組載體pBlue-NDVNP。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序驗證正確。

2.2 pET28a-NDV-NP 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定詳見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pET-NDV-NP 的酶切鑒定

由圖3可見，限制性內(nèi)切酶Eco R I 和Xho I 處理pBlue-NDV-NP 和pET-28a 載體，切膠回收，用T4 DNA 連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5α。小量提取質(zhì)粒，經(jīng)Xho I 單酶切和Xho I、Eco R I 雙酶切鑒定，酶切鑒定與預期結(jié)果基本一致，表明成功構(gòu)建表達載體pET28a-NDV-NP。

2.3 重組表達載體的誘導表達、可溶性分析與目的蛋白純化 詳見圖4。

圖4 目的蛋白SDS-PAGE

由圖4可見，目標載體轉(zhuǎn)化表達工程菌BL21(DE3)，終濃度為1 mM/L 的IPTG 誘導5 h 后收集菌液，超聲破碎。SDS-PAGE 檢測結(jié)果表明:pET28a-NDV-NP 上清與沉淀都能在約55 ku 處見到表達條帶，目的蛋白與預期大小相符。誘導菌液超聲離心處理后取上清液和沉淀進行可溶性分析，結(jié)果顯示，重組蛋白主要以可溶性形式存在(見圖4第1、2 泳道)。通過Ni-NTA 樹脂純化柱純化NP 重組蛋白，取少量純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE 分析，可見較純的1 條蛋白條帶(見圖4第4 泳道)。

2.4 表達蛋白Western-blot 檢測 詳見圖5。

圖5 NP 蛋白Western-blot

由圖5可見，Western-blot 檢測，結(jié)果表明，在55 ku 處出現(xiàn)l 條清晰的反應(yīng)條帶，說明重組蛋白在大腸桿菌中得到正確表達并且具有免疫反應(yīng)原性。

3 小結(jié)與討論

ND 是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的法定上報疫病之一，嚴重危害著世界各國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展［8］。自從該病被發(fā)現(xiàn)至今，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，對ND 的預控已取得巨大成就。疫苗預防接種是控制ND 的重要措施，研制新型的基因工程疫苗是ND 疫苗研究的重要方向。研究結(jié)果表明，在NDV 編碼的6 個蛋白質(zhì)中，F(xiàn) 蛋白和HN 蛋白是NDV 的主要保護性抗原［9］。同時有研究發(fā)現(xiàn)，NP蛋白具有很好的免疫原性，單獨免疫NP 蛋白就能產(chǎn)生較高的抗NP 蛋白抗體［10］。

原核表達系統(tǒng)具有成本低、表達量高、純化方便等優(yōu)點，是獲得重組蛋白的首選。大腸桿菌中表達目的蛋白的形式有兩種:包含體和可溶性蛋白。本試驗將誘導菌液經(jīng)過超聲裂解和表達產(chǎn)物上清與沉淀經(jīng)蛋白質(zhì)電泳分析，重組目的蛋白主要存在于超聲處理的菌液上清中，便于純化處理操作。采用蛋白純化樹脂Ni-NTA 柱對目的蛋白進行純化，不影響蛋白活性、操作簡單、純化效果較好。

本研究通對NDV LaSota 株NP 基因的克隆和原核表達，成功獲得重組NDV NP 蛋白。通過其在體外的大量表達，可作為診斷抗原，亦可用其制備抗血清及單克隆抗體，進行疾病診斷，為NDV 在分子水平上進行特異性診斷奠定堅實基礎(chǔ)。

另外，NP 基因的克隆與表達，可作為進一步探討該病毒的分子致病特性及亞單位疫苗的研制提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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