李冬兵 趙 凱 劉 學(xué)鋒 王 一 曾 澤彬

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌蠶桑研究所，四川宜賓 6 44600)

氟化物添食對家蠶耐氟品種和敏感品種5齡幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶含量的影響

李冬兵 趙 凱 劉 學(xué)鋒 王 一 曾 澤彬

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌蠶桑研究所，四川宜賓 6 44600)

為探明家蠶耐氟化物機理，以家蠶耐氟品種T6和敏感品種734為材料，通過人工添食NaF的方法測定了其血液與中腸組織蛋白質(zhì)及谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活力。結(jié)果表明:隨著NaF添食濃度的增加，敏感品種734血液蛋白質(zhì)濃度低于耐氟品種T6血液蛋白質(zhì)濃度，而兩者中腸組織的蛋白質(zhì)濃度無明顯差異。敏感品種734血液及中腸組織的GSTs酶活力呈現(xiàn)幅度較大的波動;耐氟品種T6血液中的GSTs酶活力呈現(xiàn)上升趨勢，中腸組織的GSTs酶活力波動的幅度較小。由此可見，耐氟家蠶品種能夠在氟化物的調(diào)控下提高體內(nèi)GSTs的含量，推測其為耐氟家蠶品種具有氟化物抗性的原因之一。

家蠶;氟化物;耐氟品種;敏感品種;谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶;抗性

氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，其廣泛存在于自然界中。氟化物對家蠶具有較強的毒害作用，可與家蠶細(xì)胞、組織及器官相互作用，引發(fā)一系列生物物理或生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致效應(yīng)器官生理機能下降，最終導(dǎo)致家蠶死亡。當(dāng)前，我國工業(yè)飛速發(fā)展，大氣氟污染也隨之日益嚴(yán)重，蠶區(qū)家蠶氟化物中毒事件時有發(fā)生，對蠶業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，選育耐氟化物家蠶品種顯得尤為重要。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類多基因家族編碼的解毒酶，其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電基團與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合，形成更易溶解的、沒有毒性的衍生物，使其易于排出體外或者被相關(guān)代謝酶類分解［1－3］。由此可見，生物體遇到逆境時，GSTs可發(fā)揮脫毒與抗氧化的功能［4］。因此，GSTs與昆蟲代謝抗性具有一定的相關(guān)性，即昆蟲體內(nèi)解毒酶的解毒能力增強是產(chǎn)生抗性的原因之一［5］。

本研究以家蠶耐氟品種和敏感品種為材料，通過人工添食NaF得到不同中毒程度的家蠶幼蟲，測定2種家蠶品種體內(nèi)血液與中腸組織中蛋白質(zhì)及GSTs酶活力的差別，找出氟化物對家蠶蛋白質(zhì)及GSTs的影響，為探明家蠶耐氟機理及氟化物對鱗翅目昆蟲的毒害機理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試家蠶品種:耐氟品種T6、敏感品種734，均由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶生物育種實驗室提供。

主要試劑:考馬斯亮藍G－250(Coomassie brilliant blue G－250)為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品，谷胱甘肽－S轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒為南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品?？捡R斯亮藍G－250的配制:稱取10 mg考馬斯亮藍G－250，溶于5 mL 95%的乙醇中，加入85%(v/v)的磷酸10 mL，最后用蒸餾水定容到100 mL，置于4℃的冰箱中保存;pH=7的磷酸緩沖液的配制:按磷酸氫二鈉∶磷酸二氫鈉=61∶39的體積比配成。1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的配制:準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于10 mL的蒸餾水中。

主要試驗儀器:酶標(biāo)儀，由BIO－RAD公司生產(chǎn);T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計，由北京普析通用有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計及樣品制備 供試耐氟品種T6、敏感品種734的家蠶，4齡前按普通飼育條件飼養(yǎng)［6］，5齡起蠶時數(shù)蠶分區(qū)，每個蠶品種各分為4區(qū)，每區(qū)400頭蠶，試驗區(qū)分別使用涂了0(對照)、50、100、200 mg/kg NaF溶液的桑葉飼育，每天喂3次，以添食24 h后為梯度，一直添食至第7天;分別于5齡第1天至第6天，從各處理組中隨機選取10頭家蠶，取血液和中腸制備酶液，于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 家蠶血液和中腸組織蛋白質(zhì)含量的測定參照參考文獻［7］的方法制作蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用考馬斯亮藍G－250法，測定樣品的蛋白質(zhì)含量［7］。分別取PBS稀釋10倍的血液和中腸組織的酶液0.02 mL，加入1 mL考馬亮藍G250，25℃水浴2 min，在酸標(biāo)儀中595下測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出家蠶體內(nèi)血液和中腸組織蛋白質(zhì)含量(μgpro·insect)。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 家蠶血液GSTs酶活力的測定 參照南京建成生物工程有限公司生產(chǎn)的谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶試劑盒說明書。將基質(zhì)液、家蠶血液于測定管中混勻后37℃水浴30 min，然后加入試劑2與家蠶血液，離心后進行顯色反應(yīng)。

單位定義:規(guī)定每毫升血清在37℃反應(yīng)1 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽(GSH)濃度降低1 umol/L為1個酶活力單位。

1.2.4 家蠶中腸組織GSTs酶活力的測定 試驗方法同 1.2.3。

單位定義:規(guī)定每毫克中腸組織蛋白，在37℃反應(yīng)1 min，扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為1個酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶血液中蛋白質(zhì)含量的變化

由試驗結(jié)果(表 1)可知，當(dāng) NaF的濃度為50 mg/kg時，敏感品種734與耐氟品種T6家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量無明顯差異;當(dāng)濃度高于50 mg/kg時，耐氟品種T6家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量高于敏感品種734家蠶血液中蛋白質(zhì)的含量，這可能與其均有較高的耐氟化物特性有關(guān)。

表1 添食不同濃度NaF對不同品種5齡家蠶血液蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 家蠶中腸組織蛋白質(zhì)含量的變化

敏感品種734與耐氟品種T6各處理區(qū)與對照區(qū)的家蠶中腸組織蛋白質(zhì)的含量無明顯差異;隨著添氟天數(shù)的增加，中腸組織蛋白質(zhì)的含量出現(xiàn)上下波動，但波動的幅度較小，表明氟化物對家蠶中腸組織蛋白質(zhì)的含量沒有明顯影響(表2)。

表2 添食不同濃度NaF對不同品種5齡家蠶中腸組織蛋白質(zhì)含量的影響

2.3 家蠶血液中GSTs酶活力的變化

2.3.1 敏感品種734家蠶血液中GSTs酶活力的變化 敏 感品種734的5齡家蠶添食NaF后血液中GSTs酶活力變化如圖2所示。當(dāng)NaF的濃度為50 mg/kg時，血液GSTs酶活力接近對照組，且變化趨勢相近;添氟濃度高于50 mg/kg時，與對照組相比GSTs酶活力出現(xiàn)上下波動，變化趨勢差異較明顯，表明家蠶正常生理活動出現(xiàn)紊亂，出現(xiàn)氟中毒的跡象。到5齡第6天時，隨著添氟濃度的增加血液中GSTs酶活力逐漸地減少。

圖2 添食NaF對敏感品種734家蠶血液GSTs酶活力的影響

2.3.2 耐氟品種T6家蠶血液中GSTs酶活力的變化 耐氟品種T6的5齡家蠶添食NaF后血液中GSTs酶活力變化規(guī)律較為明顯，添氟組的血液中GSTs酶活力值基本高于對照組，且隨著添氟濃度的增大，其GSTs酶活力值隨之變大(圖3);由此可知，氟化物可誘導(dǎo)耐氟品種T6血液中GSTs的合成。到5齡第6天，試驗區(qū)與對照區(qū)GSTs酶活力差別不大。比較圖2與圖3可以看出，隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加，在相同添氟濃度下，T6的5齡家蠶血液中GSTs酶活力隨著氟濃度增高而成上升趨勢，而敏感品種734則出現(xiàn)上下波動;耐氟品種T6的血液中的GSTs酶活力大于敏感品種734。

圖3 添食NaF對耐氟品種T6家蠶血液GSTs酶活力的影響

2.4 家蠶中腸組織GSTs酶活力情況

2.4.1 敏感品種734家蠶中腸組織GSTs酶活力情況 敏感品種734的5齡家蠶添食NaF后家蠶中腸組織GSTs酶活力變化如圖4所示。當(dāng)NaF的濃度為50 mg/kg時，隨著添氟天數(shù)的增加，家蠶中腸組織GSTs酶活力值接近對照組;當(dāng)添氟濃度大于50 mg/kg時，隨著添氟天數(shù)的增加，家蠶中腸組織GSTs酶活力值出現(xiàn)較大的波動。這表明添氟濃度為50 mg/kg時，敏感品種734正常的生理活動開始受到影響，隨著添氟天數(shù)的增加，影響變大。

圖4 添食NaF對敏感品種734家蠶中腸組織GSTs酶活力的影響

2.4.2 耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力情況 耐氟品種T6的5齡家蠶添食NaF后中腸組織GSTs酶活力變化如圖5所示。當(dāng)添氟濃度為200 mg/kg時，隨著添食天數(shù)的增加，耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力均低于對照組，GSTs酶活力呈現(xiàn)下降的趨勢;當(dāng)添氟濃度低于200 mg/kg時，添氟組家蠶中腸組織GSTs酶活力接近或高于對照組，說明添氟濃度為200 mg/kg時，耐氟品種T6家蠶的正常生理活動受到影響。到5齡第6天時，隨著添氟濃度的增加中腸組織GSTs酶活力逐漸減少。對比圖4和圖5可知，隨著5齡家蠶添氟天數(shù)的增加，耐氟品種T6各添氟組家蠶中腸組織GSTs酶活力波動的幅度較小，而敏感品種734各添氟組中腸組織GSTs酶活力波動的幅度較大。

圖5 添食NaF對耐氟品種T6家蠶中腸組織GSTs酶活力的影響

3 討論

耐氟品種T6與敏感品種734血液與中腸組織蛋白質(zhì)的含量，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，都未見明顯的變化，因此推測氟化物對家蠶體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量影響較小;但耐氟品種T6家蠶的血液中GSTs酶活力的變化有一定的規(guī)律性，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，其血液中的GSTs酶活力也相應(yīng)增加，而其中腸組織GSTs酶活力波動的幅度較小，表明氟化物對蠶血液的毒害作用比中腸低。

敏感品種734各添氟組蠶的血液及中腸組織GSTs酶活力變化無明顯規(guī)律，隨著添氟天數(shù)和濃度的增加，其GSTs酶活力值出現(xiàn)較大幅度的波動，但最終呈下降趨勢。這表明氟對敏感品種734中腸及血液的毒害均較大。有研究結(jié)果表明，對天然的有毒物質(zhì)、工業(yè)污染及化學(xué)農(nóng)藥具有抗性的昆蟲，體內(nèi)的GSTs酶含量通常都比無抗性的昆蟲高［8］，說明昆蟲體內(nèi)GSTs活性的升高是產(chǎn)生抗性的重要原因之一。因此，推測家蠶對氟化物的抗性可能與體內(nèi)GSTs酶活力的高低有關(guān)。

從耐氟品種T6中腸組織的GSTs酶活力變化可以看出，在一定范圍內(nèi)，氟化物能夠促進家蠶體內(nèi)GSTs酶含量的增加。由于GSTs基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為GSTs酶，由此推測，一定濃度范圍內(nèi)的氟化物，可能會引起GSTs酶相關(guān)基因表達的上調(diào)［9］。如果這一推測成立，就意味著GSTs基因以表達量的增加維持體內(nèi)GSTs酶的正常水平及功能，從而形成抗性。這一推測還需要進一步的試驗驗證。

耐氟品種T6的氟化物抗性較高但經(jīng)濟性狀較差，敏感品種734具有良好的經(jīng)濟性狀卻不耐氟;因此，如將T6的氟化物抗性基因?qū)朊舾衅贩N734中，使734成為具有良好經(jīng)濟性狀的抗氟化物蠶品種是今后的研究方向。

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S881.2

A

1007－0982(2014)02－0008－05

2013－12－19;

2014－01－13

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號CARS－22)。

李冬兵(1988—)，男，云南曲靖，本科，助理農(nóng)藝師。

Tel:0831－6256573，E-mail:ldbing123@126.com

劉學(xué)鋒(1963—)，男，四川宜賓，本科，高級農(nóng)藝師。

Tel:0831－6256573，E-mail:yibinshiyongjun@163.com