許慧萍，楊桂軍＊＊，周 健，秦伯強(qiáng)，張光生，鄒 華，胡細(xì)全

(1:江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，無錫 214122)

(2:中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊環(huán)境與科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008)

(3:湖北大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430062)

伴隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量污染物的產(chǎn)生和排放致使水體富營(yíng)養(yǎng)化日趨嚴(yán)重.由于水體富營(yíng)養(yǎng)化，太湖最近每年的5-10月都會(huì)出現(xiàn)微囊藻水華，給太湖周邊的社會(huì)生活和生產(chǎn)造成重大影響和損失[1].盡管對(duì)微囊藻水華進(jìn)行了大量研究[2-3]，然而，到目前為止微囊藻水華暴發(fā)機(jī)理還不清楚.

在自然水體中，微囊藻水華暴發(fā)時(shí)，大量微囊藻以群體狀態(tài)漂浮在水體表層[4].微囊藻群體的大小對(duì)微囊藻在水體中的遷移速度[5-7]、抗捕食壓力[8]和比表面積有重要影響.Wu 等[9]發(fā)現(xiàn)太湖微囊藻水華暴發(fā)時(shí)，微囊藻大群體更容易克服水體擾動(dòng)產(chǎn)生的包裹力，同時(shí)微囊藻大群體對(duì)太陽輻射的晝夜變化反應(yīng)不敏感，無論是有風(fēng)還是無風(fēng)的情況，大于120 μm 的微囊藻大群體總是聚集于水面上層.Cao 等[10]野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)太湖大于200 個(gè)細(xì)胞的大群體微囊藻是構(gòu)成6月份微囊藻水華的重要組成部分.

在野外條件下，微囊藻主要以群體形態(tài)存在[6]，而轉(zhuǎn)入室內(nèi)培養(yǎng)后以單細(xì)胞和兩細(xì)胞形態(tài)為主[10-12].微囊藻單細(xì)胞如何轉(zhuǎn)變?yōu)槿后w微囊藻這一問題引起了關(guān)注.有研究顯示，很多因素都可以誘導(dǎo)單細(xì)胞微囊藻形成群體微囊藻，包括生物因子，如鞭毛蟲的攝食[6，13-15]、后生浮游動(dòng)物攝食[16]、異養(yǎng)菌的誘導(dǎo)作用[17];化學(xué)因子，如微囊藻毒素[18];物理因子，如高光照強(qiáng)度[19].盡管有關(guān)微囊藻單細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿后w的研究已經(jīng)取得了很多進(jìn)展，然而到目前為止，其機(jī)理還不是很清楚.

微囊藻大群體都是由微囊藻小群體生長(zhǎng)而來.影響微囊藻群體生長(zhǎng)的的因素有很多，包括浮游動(dòng)物捕食等生物因素以及營(yíng)養(yǎng)鹽、光照、溫度等非生物因素.營(yíng)養(yǎng)鹽是影響微囊藻的主要非生物因子之一，其中氮和磷是影響微囊藻生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)元素.有關(guān)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)微囊藻生長(zhǎng)的影響，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了大量的研究[20-26]，但這些研究都是探討氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)微囊藻單細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，而有關(guān)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)微囊藻群體生長(zhǎng)影響的研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道.水華微囊藻是太湖微囊藻水華的主要優(yōu)勢(shì)種之一[27].本研究以水華微囊藻小群體為研究對(duì)象，以近幾年太湖微囊藻水華暴發(fā)最嚴(yán)重的梅梁灣氮磷比的平均值作參考，通過設(shè)置不同的氮、磷營(yíng)養(yǎng)濃度，探討氮、磷濃度對(duì)水華微囊藻小群體生長(zhǎng)的影響，將有助于人們了解太湖微囊藻水華暴發(fā)機(jī)理.

表1 實(shí)驗(yàn)各組培養(yǎng)基中的總氮、總磷濃度Tab.1 Concentrations of TN，TP and culture medium in treatments in this experiment

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)用的水華微囊藻1028 來源于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所，所有藻種接種于含改良的BG-11液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照設(shè)置為3000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h.藻種在BG-11 培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，藻種中含有一定量的水華微囊藻單細(xì)胞、兩細(xì)胞以及小群體后正式開始實(shí)驗(yàn)(藻種中含22.1% 小群體，群體平均大小為3.8 cells).取培養(yǎng)好的藻種分別加入100 ml無氮和無磷的 BG-11 培養(yǎng)液，總氮(TN)、總磷(TP)濃度設(shè)置見表1.實(shí)驗(yàn)中 T1 ～ T4 氮磷比(20∶1)模擬近幾年太湖藍(lán)藻水華暴發(fā)最嚴(yán)重的梅梁灣氮磷比的平均值.T5 中的氮、磷濃度為正常BG-11 培養(yǎng)基中的氮、磷濃度.實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3 個(gè)平行樣，在上述條件下置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，錐形瓶每天搖動(dòng)一次.每3 天取樣一次并在顯微鏡(Nikon E200)下觀察計(jì)數(shù).測(cè)定微囊藻群體大小時(shí)通常直接測(cè)定群體的直徑.這樣的方法對(duì)于野外緊密型的微囊藻群體比較適合.但經(jīng)觀察在室內(nèi)培養(yǎng)下的微囊藻群體呈現(xiàn)較松散的立體空間結(jié)構(gòu)，且群體沒有固定的形態(tài)，使用通常的方法測(cè)定誤差較大.為避免這樣的誤差，本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定單個(gè)群體的細(xì)胞數(shù)來表示群體的大小.本研究中選取了單細(xì)胞、雙細(xì)胞、3 ～10 細(xì)胞的群體、含10 ～100 細(xì)胞的群體以及100 +細(xì)胞(＞100 cells)的群體進(jìn)行計(jì)數(shù)[10].本研究中細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)要求單細(xì)胞、雙細(xì)胞至少取100 個(gè)視野;測(cè)定群體大小時(shí)至少測(cè)定50 群體，然后取平均值.

2 結(jié)果

2.1 不同氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)水華微囊藻群體大小的影響

本實(shí)驗(yàn)中，處理組T1、T2、T3 和T4 均有大于100 細(xì)胞的群體形成，而處理組T5 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)有較大群體形成(圖1 和圖2).其中，T1、T2、T3 和 T4 組的大群體平均大小依次是151、217、437 和160 cells(圖2)，T3 組中群體平均大小最大(圖1)，表明這個(gè)水平的氮、磷濃度最有利于水華微囊藻群體的增長(zhǎng).T5 組中初始時(shí)有3 ～10 細(xì)胞的群體以及10 ～100 細(xì)胞的群體形成，而后消失，表明這個(gè)水平的氮、磷濃度過高，不利于水華微囊藻群體的生長(zhǎng)，這也可能是在實(shí)驗(yàn)條件下微囊藻以單細(xì)胞和兩細(xì)胞形態(tài)存在的原因.

圖1 實(shí)驗(yàn)中不同氮、磷濃度培養(yǎng)下水華微囊藻群體大小比較Fig.1 Contrasting on size of M.flos-aquae colonies under different N and P concentrations in this experiment

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，群體大小隨營(yíng)養(yǎng)鹽濃度變化而變化.T1、T2、T3 和T4 組中群體大小基本上呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而T5 組中則呈下降趨勢(shì)(圖3).T5 組中10 ～100 細(xì)胞群體在第12 d 時(shí)開始消失(圖3B).

2.2 不同氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度對(duì)水華微囊藻群體密度的影響

隨著氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度從TN=0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L 升高至TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L，水華微囊藻群體密度依次增高，且大于100 細(xì)胞的群體所占比例逐漸增大，TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時(shí)群體密度達(dá)到最大;營(yíng)養(yǎng)鹽濃度升高至TN =250 mg/L、TP =5.44 mg/L 時(shí)，群體密度開始逐漸減小，T5 組中大于100 細(xì)胞的群體所占比例為0(圖4).這表明當(dāng)TN=10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時(shí)利于水華微囊藻群體大小的增長(zhǎng)，而過高的氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度則會(huì)制約其群體的形成.

當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較低時(shí)(TN=0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L)，各群體密度增長(zhǎng)趨勢(shì)并不明顯(圖5A);隨著營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的升高，水華微囊藻群體密度逐漸增大，T2 組中10 ～100 細(xì)胞群體和大于100 細(xì)胞群體密度開始呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖5B);TN =10 mg/L、TP =0.5 mg/L 時(shí)大于100 細(xì)胞的群體密度增長(zhǎng)速度最快，第21 d時(shí)超大群體比例最大，而單細(xì)胞數(shù)量幾乎為0(圖5C);TN =100 mg/L、TP =5 mg/L 時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各群體密度也逐漸增大，相比較而言，10 ～100 細(xì)胞的群體密度大于100 +細(xì)胞的群體密度(圖5D);T5組中，細(xì)胞密度也以較快速度增長(zhǎng)，其中雙細(xì)胞增長(zhǎng)速度最快，10 ～100 細(xì)胞的群體在培養(yǎng)第12 d 時(shí)消失，其后一直以單細(xì)胞、雙細(xì)胞以及3 ～10 細(xì)胞的群體形態(tài)存在(圖5E).

圖2 實(shí)驗(yàn)中不同氮、磷濃度水平水華微囊藻群體平均大小比較Fig.2 Contrasting on mean size of M.flos-aquae colonies under different N and P concentrations

圖3 實(shí)驗(yàn)中不同氮、磷濃度水華微囊藻群體大小隨時(shí)間變化情況Fig.3 The variation of M.flos-aquae colony size under different N and P concentrations

3 討論

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)TN≤10 mg/L、TP≤0.5 mg/L時(shí)，氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度增加有利于水華微囊藻群體增大;當(dāng)TN ＞10 mg/L、TP ＞0.5 mg/L 以后，氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度增加抑制水華微囊藻群體增長(zhǎng)，不利于水華微囊藻群體增大.研究證實(shí)，隨著外界環(huán)境的改變，生物的表現(xiàn)型會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變[28-29].微囊藻聚集效應(yīng)是微囊藻應(yīng)對(duì)環(huán)境改變最常見的方式.藻類群體中各細(xì)胞的聚集主要依靠的是具有粘性的胞外多聚糖，因此，浮游植物群體的形成與胞外多聚糖的含量有著直接的關(guān)系[30-34].Yang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻群體形成后胞外多聚糖要顯著多于單細(xì)胞胞外多聚糖.張民等[35]研究也發(fā)現(xiàn)群體微囊藻比單細(xì)胞微囊藻具有更多的胞外多聚糖.大量研究表明，細(xì)胞胞外多糖的分泌與生物和非生物因子(如:光照、營(yíng)養(yǎng)鹽和溫度等)有重要關(guān)系.楊州等[13]發(fā)現(xiàn)在原生動(dòng)物的強(qiáng)牧食壓力下銅綠微囊藻胞外多聚糖分泌量明顯增加.魚腥藻的胞外多聚糖的釋放受到溫度的影響[36].在一定的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，藍(lán)藻胞外多糖的含量隨著光照強(qiáng)度的增加而增加，光照強(qiáng)度促進(jìn)了藻類碳水化合物的產(chǎn)生以及胞外多糖的聚合[36-37].

在自然水體中，N、P 濃度是影響浮游植物生長(zhǎng)的最主要營(yíng)養(yǎng)元素[38].研究證實(shí)，經(jīng)分離純化后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室的單細(xì)胞微囊藻的胞外多糖含量比野外大群體的小得多[39]，因此影響胞外多糖分泌的因素在微囊藻群體的形成上也可能發(fā)揮了至關(guān)重要的作用.作為細(xì)胞物質(zhì)合成的主要元素，氮、磷對(duì)胞外多糖的影響一直是研究的重點(diǎn).De Philippis 等[40]研究發(fā)現(xiàn) N限制條件能促進(jìn)藍(lán)藻體內(nèi)胞外多糖的合成，而在P饑餓或P 缺乏時(shí)，一些藻類的多聚糖含量也會(huì)升高[41-42].有研究證實(shí):相對(duì)的磷限制、氮限制或碳過量(即在較高的C/N 或C/P)能促進(jìn)一些藻類或細(xì)菌胞外多聚糖的分泌，可能有助于細(xì)胞的聚合[31，43-44].Otero 等[45-46]發(fā)現(xiàn)，在氮限制或碳過飽和，也就是在不平衡的高碳氮比下，念珠藻(Nostoc sp.)可產(chǎn)生更多的胞外多聚糖，而在含氮豐富的培養(yǎng)基中，念珠藻的胞外多聚糖產(chǎn)量很低.Moreno等[36]發(fā)現(xiàn)魚腥藻(Anabaena sp.)胞外多聚糖產(chǎn)量與培養(yǎng)基中氮的總量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系.研究結(jié)果表明，N 限制能夠促進(jìn)水華微囊藻碳水化合物的合成[47].陽振[19]發(fā)現(xiàn)將銅綠微囊藻(M.aeruginosa)培養(yǎng)在N 濃度為1.98 mg/L、P 濃度為0.65 mg/L或N 濃度更低的條件下，胞外多糖的合成明顯增加.Liu 等[48]用乙醛酸模擬營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)柵藻(S.obliquus)多糖產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的乙醛酸對(duì)柵藻的增長(zhǎng)無明顯影響，而高濃度則抑制其生長(zhǎng)，且乙醛酸處理組中，有柵藻群體形成，實(shí)驗(yàn)組中多糖產(chǎn)量、乙醛酸含量以及顆粒細(xì)胞數(shù)兩兩呈現(xiàn)正相關(guān)，Yang 等[49]在多糖含量對(duì)小球藻(C.pyrenoidosa)群體聚集影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)多糖含量隨乙醛酸濃度的增加而增加，且胞外多糖含量同小球藻群體大小直接相關(guān).

圖4 實(shí)驗(yàn)中不同氮、磷濃度水華微囊藻各形態(tài)的平均密度Fig.4 The mean density of different units of M.flos-aquae under different N and P concentrations in this experiment

圖5 實(shí)驗(yàn)中不同氮、磷濃度下水華微囊藻各形態(tài)平均密度隨時(shí)間的變化Fig.5 The density variation of different units of M.flos-aquae under different N and P concentrations in this experiment

本實(shí)驗(yàn)中，T5 處理組所用培養(yǎng)基為含N 和P 極高的BG-11 培養(yǎng)基(TN=250 mg/L、TP=5.44 mg/L)，一直未形成超大群體，大群體也在隨后幾天消失.高濃度的氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽可能抑制了微囊藻細(xì)胞胞外多糖的分泌，最終制約了微囊藻群體的形成.T1 組中大群體在第12 d 后開始緩慢減少，T1 組中氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度水平較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)鹽逐漸被消耗，因此大群體密度開始逐漸減少.本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度梯度中，TN =10 mg/L、TP=0.5 mg/L 時(shí)微囊藻超大群體大小最高達(dá)到900 cells(圖3C)，因此，在一定范圍內(nèi)，其群體密度隨著營(yíng)養(yǎng)鹽含量的升高而升高.過高的營(yíng)養(yǎng)鹽則制約了胞外多糖的合成，由此可以得到T5 組多為單細(xì)胞和雙細(xì)胞而沒有超大群體形成的原因.通常情況下，實(shí)驗(yàn)室中多用BG-11 培養(yǎng)基培養(yǎng)微囊藻，由此可以解釋為何在實(shí)驗(yàn)室條件下很難獲得微囊藻群體.本研究表明，適宜的氮、磷濃度有利于微囊藻群體的生長(zhǎng)，過低或過高的氮、磷濃度都不利于微囊藻群體的生長(zhǎng).

梅梁灣位于太湖北部，每年5-10月微囊藻水華暴發(fā)頻繁[1].同世界各地富營(yíng)養(yǎng)化湖泊一樣，梅梁灣氮、磷水平較高(平均TN=4.57 mg/L、TP=0.165 mg/L)[50-51].水華微囊藻是太湖微囊藻水華暴發(fā)的主要優(yōu)勢(shì)種之一[52].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從T1 ～T3，隨氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度增加，微囊藻藻群體也增大，其中，T1 為TN =0.1 mg/L、TP=0.005 mg/L;T3 為 TN=10 mg/L、TP=0.5 mg/L，太湖梅梁灣的氮、磷濃度處于 T1 ～ T3 之間，說明目前太湖氮、磷濃度水平有利于水華微囊藻群體的增長(zhǎng).本文研究結(jié)果可為解釋太湖以及其它富營(yíng)養(yǎng)水體微囊藻水華頻發(fā)提供參考.

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