朱傳龍，李毓雯，李文庭，李宜，高人燾

·慢性乙型和丙型肝炎·

慢性乙型肝炎患者肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1表達及其意義*

朱傳龍，李毓雯，李文庭，李宜，高人燾

目的分析慢性乙型肝炎患者血清和肝組織基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）表達水平與肝纖維化分期的相關(guān)性。方法分別采用免疫組化法和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測患者肝組織和血清TIMP-1表達水平，分析兩者相關(guān)性；對159例慢性乙型肝炎患者行肝活檢病理學檢查，以組織學活動指數(shù)（HAI）予以分級（G）和分期（S），分析慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平與HAI分級和纖維化分期的相關(guān)性。結(jié)果慢性乙型肝炎患者肝組織TIMP-1表達水平與其血清水平呈顯著性正相關(guān)（r=0.9521，P＜0.01）；不同肝纖維化分期（S1～S4）慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差異顯著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平與肝纖維化分期呈正相關(guān)（r=0.704，P＜0.01），但不同炎癥分級的慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平差異無顯著性。結(jié)論血清TIMP-1水平可以較好地反應肝臟纖維化程度，且不受肝組織炎癥分級的影響，有望被用于肝組織纖維化程度的臨床無創(chuàng)評估。

慢性乙型肝炎；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1；肝纖維化；炎癥

乙型肝炎肝硬化患者肝組織病理學變化的基礎是肝纖維化。肝組織活檢是目前診斷肝纖維化的金指標，但因其具有創(chuàng)傷性，容易發(fā)生出血和疼痛等并發(fā)癥而限制了其臨床應用。臨床常用的血清學指標如透明質(zhì)酸（HA）、層粘蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）等因與肝組織的炎癥壞死程度關(guān)系密切，其血清水平往往受到肝臟炎癥的影響，給臨床上正確評估肝纖維化的程度帶來一定的困難。近年來，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（TIMP-1）水平與肝組織纖維化程度呈正相關(guān)[1，2]。然而，在慢性乙型肝炎患者，兩者的相關(guān)性問題尚不

明確。本研究檢測了慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平和肝組織TIMP-1表達水平，以探討血清TIMP-1水平診斷肝纖維化分期的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究對象2007年12月～2009年10月在解放軍第123醫(yī)院和我院確診的慢性乙型肝炎患者159例，男性113例，女性46例；年齡為18～62歲，平均年齡（42.0±6.5）歲。按照慢性乙型肝炎防治指南（2010版）的診斷標準[3]診斷，排除慢性腎、肺和心臟疾病。另選同期健康獻血員10例，男性7例，女性3例；平均年齡（32.0±8.4）歲。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究在安徽省立醫(yī)院倫理委員會備案。

1.2 血清TIMP-1水平檢測采用雙抗體夾心ELISA法，抗TIMP-1單克隆抗體（McAb）購自美國Santa Cruz公司。操作步驟如下：以0.05 M碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）為包被液，將稀釋成一定濃度的抗TIMP-1單克隆抗體分別滴加在96孔聚苯乙烯板微孔內(nèi)，每孔100 μl，4 ℃過夜，次日甩盡包被液，用0.05%（v/v）Tween-20 PBS（PBST）洗板3次，每次3 min，拍干后加封閉液（含15%小牛血清的PBS）200 μl/孔，37℃1 h，4 ℃過夜，次日棄之，PBST洗滌3次，每次3 min；將標準品及待測血清（待測樣品用PBS作1∶100稀釋）加于包被孔內(nèi)，并設陰性對照、空白對照，37℃水浴1 h，PBST洗板5次，拍干后加HRP2抗TIMP-1 100μl/孔，37℃30 min，PBST洗板5次，徹底拍干后加入TMB顯色劑，50 μl/孔，37℃15 min，加2M H2SO450μl/孔，終止反應；在酶標儀（Elx800型，BIO-TEKINSTRUMENTS.INC）450 nm處測量吸光度A值（OD值，以空白對照孔調(diào)零），通過標準曲線查得待測血清TIMP-1水平。

1.3 肝組織病理學檢查采用負壓針吸肝活檢，肝組織長度為＞1.5 cm，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，行連續(xù)切片，常規(guī)HE、網(wǎng)狀纖維和Masson染色。由解放軍第123醫(yī)院病理科做出組織學診斷，其中G2S0～4患者48例，G0～4S2患者41例。

1.4 肝組織TIMP-1檢測采用SP法（免疫組化試劑盒SP-9001購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），石蠟切片4 μm，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波加熱暴露抗原，滴加兔源TIMP-1多克隆抗體（購自武漢博士德公司），1∶100稀釋，4 ℃冰箱過夜，PBS洗片后滴加羊抗兔二抗（1∶500），37℃孵育1 h，DAB顯色，控制在3～5 min，復染、脫水、透明、封片。顯色強度經(jīng)HPIAS-1000病理圖文報告分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司）進行定量分析。每張切片隨機取10個視野，計算肝組織TIMP-1表達的陽性密度值。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學處理，測定值用（±s）表示，采用t檢驗及直線相關(guān)分析，組間均數(shù)的比較采用方差分析，P＜0.05表示有顯著性統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 血清TIMP-1水平與肝組織TIMP-1表達水平的相關(guān)性在16例慢性乙型肝炎患者，同時檢測肝組織TIMP-1表達和檢測血清TIMP-1水平，結(jié)果顯示肝組織TIMP-1表達與血清水平之間呈顯著性正相關(guān)。直線回歸方程為：Y=1.078X+16.55（r=0.9521，P＜0.01，圖1）。

圖1 慢性乙型肝炎患者肝組織TIMP-1表達與血清TIMP-1水平的相關(guān)性

2.2 血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間的關(guān)系選擇本組G2S08例、G2S110例、G2S215例、G2S39例和G2S46例。檢測他們血清TIMP-1水平發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，血清TIMP-1水平逐步升高，其中G2S1與G2S2組、G2S2與G2S3組和G2S3與G2S4組之間相比，差異顯著（P＜0.01）。血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間呈顯著性正相關(guān)（r=0.704，P＜0.01，圖2）。

圖2 不同肝組織纖維化分期慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比較

2.3 血清TIMP-1水平與炎癥活動度分級之間的關(guān)系從159例慢性乙型肝炎患者中篩選出G0～4S2患者41例，其中G1S2組12例、G2S2組15例和G3S2組14例。取患者外周血清，采用ELISA法檢測TIMP-1水平。結(jié)果顯示：G1S2與G2S2組、G1S2與G3S2組、G2S2與G3S2組之間相比，血清TIMP-1水平均無顯著性差異（P＞0.05，圖3）。

圖3 不同炎癥活動度分級慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平比較

3 討論

自1995年中華醫(yī)學會傳染病學與寄生蟲病學學會、2000年中華醫(yī)學會傳染病學與寄生蟲病學會和中華醫(yī)學會肝臟病學學會聯(lián)合制定的《病毒性肝炎防治方案》把血清HA、PCⅢ、CⅣ和LN水平作為診斷肝纖維化的指標以來，由于病例選擇、檢測方法、檢測試劑等方面的差異，在應用血清標志物診斷肝組織炎癥壞死活動度和肝纖維化的程度方面結(jié)果常不一致。因為血清HA、PCⅢ、CⅣ和LN不僅與纖維化程度有關(guān)，而且與肝組織的炎癥壞死程度也可能關(guān)系密切，給臨床上正確評估肝纖維化的程度帶來一定的困難，其對肝纖維化的診斷僅起到臨床參考作用。在2003年，Rosenberg et al指出急需建立一種可靠的、重復性高的非創(chuàng)傷性監(jiān)測肝纖維化的指標，最好是一種血清學標志物,說明了血清學診斷肝纖維化的重要性[4，5]。

有關(guān)細胞外基質(zhì)（ECM）的研究發(fā)展迅速，在正常肝臟的纖維組織中存在著ECM生成與降解的動態(tài)平衡，肝纖維化是ECM生成與降解過程失衡的結(jié)果。既往對ECM的生成與沉積研究較多，近年開始對ECM降解的研究亦日益深入。在ECM降解過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的平衡起著至關(guān)重要的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組能降解細胞外基質(zhì)成分的重要蛋白分解酶，MMPs是一組鋅酶，幾乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，并能使MMPs家族其它成員相繼激活，形成瀑布效應。人體已發(fā)現(xiàn)的MMP有20種，按照作用底物不同，MMP可分為4類，即間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)溶解素、明膠酶和膜型金屬蛋白酶[6～8]。TIMPs是一組具有抑制MMPs功能的活性多肽，他們在ECM代謝的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。TIMPs在肝臟中來源主要為HSC、Kupffer細胞，以及少量來源于肝細胞。TIMPs是組織中MMPs主要的內(nèi)源性抑制因子，受許多參與MMP基因調(diào)控的細胞因子和生長因子的同步調(diào)控，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種TIMP，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，它們對目前已知的MMPs均具有抑制作用[9～11]。大量研究已經(jīng)證實，TIMP-1、TIMP-2在肝組織的過度表達與肝纖維化的形成密切相關(guān)[1，12～14]。除此之外，TIMPs家族在心、肺、腎等多種臟器的纖維化病程中也發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Heymans S et al通過對36例主動脈狹窄患者心肌標本檢測發(fā)現(xiàn)，心肌細胞TIMP-1、TIMP-2的高表達與心肌組織纖維化和功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)，說明TIMPs也是導致心室擴大和心肌重構(gòu)的主要因素之一。因此，該基因在今后可能作為主動脈狹窄患者潛在的治療靶點[15]。同樣，MMPs和TIMPs的比例失調(diào)在肺纖維化膠原代謝紊亂中起重要作用，肺組織TIMP-1和TIMP-2活性的升高可以抑制MMP-9和MMP-2活性，影響肺組織正常的修復和膠原降解，從而發(fā)生肺組織纖維化[16～18]。另外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的4種TIMPs均能在腎組織表達。大量研究表明，TIMPs在慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展中起著不可替代的作用，其中TIMP-1的過度表達是導致腎間質(zhì)纖維化的主要原因之一[19，20]。

綜上所述，TIMPs在心、肝、肺和腎臟纖維化發(fā)生機制中起重要作用，血清TIMPs（主要為TIMP-1、2）水平升高，能使MMPs活性下降，引起組織ECM積聚，促使發(fā)生纖維化。因此，目前認為血清TIMP-1和TIMP-2水平可以反映多種臟器纖維化的程度。然而，通過檢測血清TIMPs水平評估慢性肝病患者纖維化程度可能受到其他臟器組織異常分泌TIMPs水平的影響，從而影響TIMPs作為診斷肝纖維化血清指標的特異性。因此，現(xiàn)有的大部分臨床研究資料均顯示，TIMPs作為肝纖維化診斷血清學指標，其檢測的特異性相對較差[21]。

本研究中，為評估TIMP-1與慢性乙型肝炎肝纖維化的關(guān)系，所選研究對象均排除了合并有慢性心臟、腎臟和肺疾病，以及其他原因所致的慢性肝病。我們對慢性乙型肝炎患者肝組織進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，TIMP-1在肝臟的表達量逐步升高，主要表現(xiàn)在肝組織間質(zhì)細胞和部分肝細胞的陽性表達的增多。對肝組織TIMP-1表達水平進一步行半定量分析并與血清水平相比較，發(fā)現(xiàn)組織TIMP-1與血清水平之間具有顯著性正相關(guān)，說明在慢性乙型肝炎患者，血清TIMP-1水平可以很好地反映肝臟TIMP-1表達水平。因此，在今后的臨床工作中，如果能排除慢性乙型肝炎患者合并有其他臟器的纖維化疾患，血清TIMP-1水平的檢測可以代替患者肝組織TIMP-1表達的檢測，從而避免不必要的肝活檢。

在本研究中，我們對159例慢性乙型肝炎患者進行肝活檢，并予以肝組織病理學檢查。結(jié)果肝組織炎癥分級為G2的慢性乙型肝炎患者48例，其中G0期8例、G1期10例、G2期15例、G3期9例和G4期6例；肝組織纖維化分期為S2的慢性乙型肝炎患者41例，其中S1級12例、S2級15例和S3級14例。對肝組織炎癥G2級患者進行血清TIMP-1檢測，結(jié)果顯示隨著肝纖維化程度的加重，慢性乙型肝炎患者血清TIMP-1水平逐步升高，G2S1、G2S2、G2S3和G2S4四組之間TIMP-1水平相比差異顯著（P＜0.05），且血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期之間呈顯著性正相關(guān)。對41例肝組織纖維化S2期患者進行血清TIMP-1水平檢測，結(jié)果顯示G1S2、G2S2和G3S2組之間TIMP-1水平相比無顯著性差異（P＞0.05）。以上研究結(jié)果提示，血清TIMP-1水平與肝組織纖維化分期具有很好的相關(guān)性，可以反映肝組織的纖維化程度，且不受肝組織炎癥程度的影響。故在臨床上可綜合考慮及動態(tài)監(jiān)測，以更好更準確地判斷慢性乙型肝炎患者肝纖維化病程的進展趨勢。

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（收稿：2013-11-29）

（校對：陳從新）

Clinical significance of tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in livers of patients with chronic hepatitis B

Zhu Chuanlong，Li Yuwen，Li Wenting，et al.Department of Infectious Disease，Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，Anhui Province，China

Objective To evaluate the expression of tissue inhibitor of metalloproteinases-1（TIMP-1）in livers of patients with chronic hepatitis B（CHB）and to explore the potential relationship between TIMP-1 level and hepatic fibrosis progression.Methods The tissue and serum levels of TIMP-1 were determined by immunohistochemistry and double-antibody sandwich enzyme-linked immunoadsorbent assay，respectively，and their correlation was determined.One hundred and fifty-nine patients with CHB underwent liver biopsy and their liver histological activity index（HAI）and fibrosis（S）were determined.The correlation between the serum TIMP-1 levels and HAI grading and staging was analyzed.Results The expression of TIMP-1 in liver tissues were positively correlated to serum TIMP-1 levels in CHB patients（r=0.9521，P<0.01）；Serum TIMP-1 levels were significant different among patients with different liver fibrosis stages（S1to S4）（P<0.05），and a positive correlation between serum TIMP-1 level and hepatic fibrosis staging was found（r=0.704，P<0.01）；However，there were no significant differences in serum TIMP-1 levels among patients with different liver inflammatory grades.Conclusions Serum TIMP-1 level is not affected by liver inflammatory grades and is promising in non-invasive clinical evaluation of liver fibrosis.

Chronic hepatitis B；Tissue inhibitor of metalloproteinases-1；Hepatic fibrosis；Inflammation

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.007

國家自然科學基金資助項目（81271713）；安徽省第五批優(yōu)秀青年科技基金滾動支持項目（1308085JGD09）；安徽醫(yī)科大學校長基金資助項目（2011xkj074）

230001 合肥市安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院感染病科（朱傳龍，李文庭，李宜，高人燾）；兒內(nèi)科（李毓雯）

朱傳龍，男，33歲，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎的基礎與臨床研究

高人燾，E-mail：rentaogao@sohu.com