闞 曉，潘家超，荊 燕，都曉偉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏

·肝癌·

原發(fā)性肝癌患者微波消融治療后外周血T淋巴細胞亞群的變化

闞 曉，潘家超，荊 燕，都曉偉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏

目的觀察原發(fā)性肝癌患者微波消融治療前后外周血T淋巴細胞亞群的變化。方法152例原發(fā)性肝癌患者在微波消融治療前1d、治療后1 w和4 w，以流式細胞術(shù)檢測患者外周血CD4+和CD8+淋巴細胞數(shù)量，采用全自動生化免疫分析儀檢測甲胎蛋白水平。術(shù)后1 m進行肝臟CT增強掃描觀察。結(jié)果在微波消融治療后1 w和4 w，患者外周血CD4+T淋巴細胞上升至（26.5±3.8）%和（32.3±5.1）%，CD4+/CD8+比值上升至（1.12±0.43）和（1.51±0.40），而CD8+T淋巴細胞下降至（47.2±7.7）%和（28.1±7.3）%，與治療前1d時基線水平[CD4+、CD8+和CD4+/CD8+分別為（21.4±4.1）%、（58.6±7.8）%和（0.98±0.45）]比，變化有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；甲胎蛋白水平由基線水平[（1109±727）ng/ml]下降，術(shù)后1w和4w分別為（890±681）ng/ml和（215±18）ng/ml（P＜0.01）；微波消融后1m行增強CT檢查，示病灶完全滅活率為97.4%(148/152)。結(jié)論微波消融治療使原發(fā)性肝癌患者外周血T淋巴細胞亞群向CD4+T淋巴細胞優(yōu)勢轉(zhuǎn)變，可能對治療效果的取得發(fā)揮了作用。

原發(fā)性肝癌；淋巴細胞亞群；微波消融；CD4+/CD8+

原發(fā)性肝癌患者微波消融治療后外周血T淋巴細胞亞群的變化

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國常見的惡性腫瘤之一，約占全世界發(fā)病率的42%。我國肝癌年死亡率為20.4/10萬，嚴重威脅人類健康[1]。微波消融（microwave ablation，MWA）已成為肝癌微創(chuàng)治療的主要手段之一，尤其能延長中小肝癌患者的生存時間。MWA具有微創(chuàng)優(yōu)勢，并可誘導(dǎo)腫瘤患者外周血T淋巴細胞亞群的變化。本研究通過觀察肝癌患者MWA治療前后外周血CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞計數(shù)及甲胎蛋白（AFP）的變化，探討MWA對PLC患者免疫功能的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2010年2月至2012年3月我院住院并接受MWA治療的PLC患者152例，男109例，女43例；年齡31～72歲，中位年齡51歲。其中腫瘤直徑≤3 cm者123例，腫瘤直徑3 cm～5 cm者29例。肝功能Child-Pugh A級96例、B級54例、C級2例；有肝硬化者132例；手術(shù)前血清AFP＞400 ng/ml者131例，＜400 ng/ml者17例，＜13.6 ng/ml者4例。納入標(biāo)準：無大血管浸潤或肝外轉(zhuǎn)移，每個病灶均能檢測到血流，無門靜脈癌栓或肝外轉(zhuǎn)移，腫瘤直徑≤5 cm，腫瘤結(jié)節(jié)≤3個，凝血功能基本正常。近半年未接受過免疫調(diào)節(jié)劑治療。將患者分成MWA治療組和對照組，兩組在年齡、性別、體重指數(shù)、腫瘤結(jié)節(jié)等方面無顯著性差異（P＞0.05）。

1.2 治療方法治療前所有患者均簽署知情同意書。在超聲（飛利浦iU22型彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率3.5MHz）引導(dǎo)下，用一次性醫(yī)用薄膜包裹探頭經(jīng)皮肝穿刺行MWA[南京福中醫(yī)療高科有限公司生產(chǎn)的肝癌微波消融儀（METI-IV）]治療[2]，輸出功率50～90 W，微波穿刺針為MTC-180-2.0，配用蠕動泵作為水循環(huán)動力泵，冷卻水用室溫生理鹽水（20℃～22℃）。根據(jù)腫瘤體積大小確定消融時間，其標(biāo)準為：對瘤體直徑≤3 cm者，治療時間為5～8 min；對瘤體直徑3 cm～5 cm者，治療時間為8～15 min。對于一次消融不能覆蓋腫瘤體積者，則采取移位穿刺點和重復(fù)手術(shù)法，直至腫瘤被全部消融。

1.3 淋巴細胞亞群檢測采集EDTA-K2抗凝血2 ml，取100 μL，與10 μL抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP熒光抗體孵育15 min，加入溶血素2 ml，室溫孵育10 min，見液體清澈透明后，1000 r/m離心5 min，棄上清。用2 ml PBS洗2次，棄上清后，加入0.5ml PBS懸浮細胞，在2 h內(nèi)用流式細胞儀（美國BM公司生產(chǎn)的FACS Canto流式細胞儀，雙激光六色）檢測患者外周血T淋巴細胞亞群（三色熒光抗體CD4-FITC/CD8-PE/PerCR及溶血素均購自BD公司）。采用BDFACSDiva軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 觀察指標(biāo)采用Ci8200全自動生化免疫儀檢測血清AFP（美國雅培公司）；采用飛利浦16層螺旋CT-Brilliance16檢查肝臟（上海博鈺醫(yī)療器械有限公司）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和成組設(shè)計樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效情況本組患者隨訪至2012年7月，143例（94.08%）生存，9例死亡，其3 m、6 m和12 m生存率分別為100%、98.0%和94.1%。術(shù)前及術(shù)后1 m，行常規(guī)肝臟CT掃描，判斷消融效果（圖1）。典型病例術(shù)前及術(shù)后增強CT檢查結(jié)果對比病灶消融滅活率為97.4%。

圖1 A原發(fā)性肝癌術(shù)前增強CT

圖1 B微波消融后1月增強CT

2.2 MWA治療前后患者外周血CD4+、CD8+T細胞計數(shù)及AFP的變化見圖2和表1。

圖2 流式細胞儀檢測患者外周血CD4+和CD8+T細胞計數(shù)

表1 152例患者治療前后T細胞亞群（%）和AFP（±s）的變化

與治療前比，①P＜0.05；②P＜0.01

3 討論

PLC的5 a平均生存率只有7%左右[3]。MWA已成為肝癌微創(chuàng)治療的主要方法之一[4]，并取得了良好的臨床療效。小肝癌患者經(jīng)MWA治療能達到根治性效果[5]。機體的免疫功能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。在肝癌患者中，T細胞功能受抑制主要表現(xiàn)為CD4+T細胞數(shù)量下降，CD4+/CD8+比值倒置，腫瘤患者的細胞免疫功能處于抑制狀態(tài)[6，7]。AFP是肝癌細胞分泌的特征性蛋白標(biāo)志，高水平的AFP對機體免疫系統(tǒng)有明顯的抑制作用[8，9]。肝癌患者外周血T細胞數(shù)量與血清AFP濃度、腫塊大小、臨床分期和腫瘤惡性程度密切相關(guān)。

MWA治療不僅直接使腫瘤細胞凝固壞死，原位徹底滅活肝癌組織，而且還能提高免疫細胞數(shù)量及其抗腫瘤功能，而手術(shù)切除腫瘤有可能直接或間接地抑制細胞免疫[10]。MWA能提高機體免疫功能，其機制為：①MWA減輕了患者的腫瘤負荷及相應(yīng)的免疫抑制因子；②MWA在腫瘤局部造成了炎性環(huán)境，有利于抗原提呈細胞提取、加工腫瘤抗原，誘發(fā)抗腫瘤免疫；③MWA降低了免疫抑制因子的水平，腫瘤細胞分泌的可溶性IL-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）能中和活化T淋巴細胞分泌IL-2，使肝癌患者IL-2水平降低；④MWA可刺激淋巴細胞活化，釋放細胞因子，通過細胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用，增強機體的免疫力[11]。Schueller等[12]研究發(fā)現(xiàn)，熱療通過加強肝癌細胞HSP70和HSP90的表達，能增加對肝細胞癌的免疫能力；⑤AFP具有免疫抑制作用，MWA后患者AFP明顯下降，進一步解除了機體的免疫抑制。

彭齊榮[13]等人研究報道，MWA治療后肝癌患者免疫功能增強，將對肝癌患者的預(yù)后起到重要作用。本研究中，經(jīng)MWA治療1w后患者CD4+T淋巴細胞數(shù)量開始升高，CD4+/CD8+細胞比值升高，抑制性CD8+T淋巴細胞數(shù)量降低，說明患者T細胞免疫功能從術(shù)后1w開始升高，4 w后機體的免疫功能明顯升高，在MWA治療后，上述變化能持續(xù)30 d以上[14]。MWA能夠明顯改善患者機體的免疫功能。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，治療后T淋巴細胞和巨噬細胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量和巨噬細胞內(nèi)的次級溶酶體數(shù)量明顯增多，說明這些免疫細胞的功能明顯增強[15]。對患者不同部位兩個肝癌結(jié)節(jié)的MWA治療對照研究表明，消融一個結(jié)節(jié)后，另一個結(jié)節(jié)內(nèi)部免疫細胞浸潤數(shù)量也增加，體積增大，而且與治療結(jié)節(jié)內(nèi)浸潤的免疫細胞表型相同，產(chǎn)生同樣的免疫應(yīng)答反應(yīng)[16]。宿主與腫瘤的關(guān)系是一種動態(tài)平衡，MWA打破了宿主與腫瘤之間的免疫動態(tài)平衡。經(jīng)MWA治療后，絕大多數(shù)患者AFP水平恢復(fù)至正常，患者的細胞免疫功能和抗腫瘤能力得到增強，刺激了機體發(fā)揮抗腫瘤作用。外周血T細胞亞群是反應(yīng)機體細胞免疫狀態(tài)的較好指標(biāo)，檢測PLC患者MWA術(shù)后外周血T淋巴細胞亞群水平，有助于了解患者的免疫狀態(tài)，以進一步評估MWA的療效，指導(dǎo)患者的綜合治療，判斷患者預(yù)后。

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（收稿：2012-12-24）

（校對：陳從新）

Changes in peripheral T lymphocyte subsets in patients underwent microwave ablation for primary liver cancer

Kan Xiao，Pan Jiachao，Jing Yan，et al.
Infectious Disease Hospital，Shandong University，Jinan 250021，Shandong Province，China

ObjectiveTo investigate the changes of peripheral T lymphocyte subsets in patients with primary liver cancer（PLC）underwent microwave ablation.Method152 patients with PLC were recruited and received microwave ablation treatment.One day before，and 1 week and 4 weeks after the treatment，the distributions of peripheral T lymphocyte subsets were determined by flow cytometry，and serum levels of alpha fetoprotein were measured by a automatic biochemical immune analyzer.Contrast-enhanced CT scans were performed in all patients one month after the treatment.ResultsThe percentages of CD4+or CD8+T lymphocytes and the ratio of CD4+/CD8+in this series one day before the treatment were（21.4±4.1）%，（58.6±7.8）%and（0.98±0.45），respectively，while the percentages of CD4+T lymphocytes increased to（26.5±3.8）%and（32.3±5.1）%，and the CD4+/CD8+ratio increased to（1.12±0.43）and（1.51±0.40），but CD8+T lymphocytes decreased to（47.2±7.7）%and（28.1±7.3）%，respectively（P＜0.05）one week and 4 weeks after microwave ablation;serum alpha fetoprotein levels were significantly decreased from the baseline[（1109±727）ng/ml]to（890±681）ng/ml 1 week or（215±18）ng/ml 4 weeks after ablation（P＜0.01）；contrast-enhanced CT scans revealed a complete ablation rate of 97.37%（148/152）for tumors one month after therapy.ConclusionsMicrowave ablation for PLC shifts the distribution of peripheral blood T lymphocyte subsets toward a CD4+cells-favorite status，which might play a role in improving the efficacy of the therapy.

Hepatoma；Microwave ablation；T lymphocyte subsets

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.021

250021濟南市山東大學(xué)附屬濟南市傳染病醫(yī)院介入科（闞曉，史兆章，韓紹磊，張海濤，鄭昭敏）；檢驗室（荊燕）；醫(yī)學(xué)院（潘家超）；山東省濰坊市昌樂縣人民醫(yī)院感染病科（都曉偉）

闞曉，40歲，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。主要從事肝癌診斷與治療學(xué)研究。E-mail:jinankanxiao@sina.com

共同第一作者：潘家超男，25歲，碩士研究生

鄭昭敏，E-mail:zhaominzheng6808@126.com