郝清亞，王以浪，姚登福，繆亞軍，印 滇

·肝癌·

肝癌患者血清microRNA-21水平變化*

郝清亞，王以浪，姚登福，繆亞軍，印 滇

目的分析不同肝病患者血清microRNA-21（miR-21）水平，以探討miR-21對(duì)肝細(xì)胞癌（HCC）的診斷價(jià)值。方法以實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)正常人、慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和HCC患者（各組均為25例）血清miR-21水平，分析miR-21水平與HCC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果正常人、CHB和肝硬化患者血清miR-21相對(duì)水平分別為（1.1±1.7）、（2.3±2.6）和（2.8±2.5），而HCC患者為（22.6±4.4），顯著高于前三組（P＜0.001）；HCC患者術(shù)后1w和1m血清miR-21相對(duì)水平分別為（18.4±3.5）和（3.1±2.7），均較術(shù)前顯著降低（P＜0.001）；HCC患者血清miR-21水平與腫瘤大小、癌栓以及HBV感染相關(guān)，與腫瘤分化程度、數(shù)目和血清AFP水平無(wú)相關(guān)性。結(jié)論miR-21在HCC患者血清中顯著升高，可能作為HCC早期診斷的潛在標(biāo)志。

肝細(xì)胞癌；miRNA-21；血清；診斷

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的死亡率在全球惡性腫瘤中排在第三位，在我國(guó)排在第二位。AFP仍然是目前臨床應(yīng)用最廣泛的HCC標(biāo)記物，但其陽(yáng)性率僅為70%左右[1]，尋找特異性生物標(biāo)記物是HCC早期診斷的研究熱點(diǎn)[2]。微小RNA（microRNA， miRNA）是一類(lèi)非編碼單鏈小RNA分子，由22個(gè)核苷酸（nucleotide，NT）組成，以互補(bǔ)配對(duì)方式與靶基因堿基結(jié)合，通過(guò)多種途徑抑制mRNA的翻譯，發(fā)揮類(lèi)似癌基因和抑癌基因的作用。研究表明，多種miRNA參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展[3，4]。microRNA-21（miR-21）通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因，參與HCC的發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等。miRNA在外周血中可穩(wěn)定存在[5]。本文以熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)了HCC、乙型肝炎、肝硬化患者和正常人外周血miR-21水平，分析其在手術(shù)前后的變化及其與腫瘤大小、分化程度、轉(zhuǎn)移等病理學(xué)特征的關(guān)系，以探討其在HCC診斷中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源收集2010年1月～2012年1月我科診治的HCC患者25例，男性19例，女性6例；年齡在35～68歲，平均年齡（50.8±7.8）歲。經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)診斷，并符合2009年發(fā)布的《原發(fā)性肝癌規(guī)范化診治專(zhuān)家共識(shí)》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受過(guò)放、化療及介入治療。另選擇健康體檢者、慢性乙型肝炎和肝硬化患者各25例。CHB和肝硬化診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[7]。納入標(biāo)準(zhǔn)：血清ALT水平升高（≥2ULN），HBV DNA≥1×105拷貝/毫升。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染甲、丙、丁、戊型肝炎，脂肪肝、酒精性肝病、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病。在HCC患者中，腫塊直徑≥5 cm 16例，＜5 cm 9例，其中＜3 cm 5例；高分化、中分化和低分化分別為6例、7例和12例。伴有癌栓8例，無(wú)癌栓17例。AFP＞400 μg/L10例，≤400 μg/L 15例。HBsAg陽(yáng)性21例，陰性4例。

1.2 血清miR-21定量檢測(cè)抽取靜脈血5ml，加入含有EDTA試管中。2h后1600 g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的EP試管中，再16000 g離心10 min，抽提總RNA（美國(guó)Molecular Research Cente公司）。合成第一鏈cDNA（以色列Fermentas公司）。檢測(cè)miR-21和miR-16 qRT-PCR引物由上海英駿生物公司合成（表1）。采用EzOmicsTM一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清miRNA（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）。將miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qPCR定量反應(yīng)放在一個(gè)試管中進(jìn)行。每個(gè)樣本取50 ng RNA，qPCR混合物12.5μL，miRNA-21反轉(zhuǎn)錄引物（10μmol/L）0.5μL。取miRNA-21正、反向引物各0.5μL（10μmol/L），加入RNA酶抑制劑，再加ddH2O至25μL，進(jìn)行擴(kuò)增。miR-21表達(dá)量的計(jì)算以miR-16為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)定量PCR的Ct（cycle threshold）均值來(lái)表示，相對(duì)定量采用2－ΔΔCt來(lái)計(jì)算[8]。該方法是目的基因與內(nèi)參基因的Ct值比較后（ΔCt），再將不同肝病組與正常組比較（ΔΔCt）。ΔCt＝（Ct miR-21－Ct miR－16），ΔΔCt＝［（Ct miR-21－Ct miR－16）不同肝病患者－（Ct miR-21-Ct miR－16）正常人］，2－ΔΔCt的數(shù)值反映血清miR-21相對(duì)于正常人血清水平的倍數(shù)（定量PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像分析儀和核酸蛋白分析儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司）

表1 檢測(cè)miR-21的引物序列

1.3 血清AFP定量檢測(cè)采用ELISA法（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以（±s）表示。多個(gè)樣本均數(shù)間的比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性時(shí)進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)行t檢驗(yàn)。采用雙變量線(xiàn)性回歸分析相關(guān)性。以P＜0. 05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人群血清miR-21水平比較見(jiàn)表2。HCC患者血清miR-21水平顯著高于正常人、CHB和肝硬化患者（P＜0.05），HCC患者術(shù)后1w血清miR-21水平較術(shù)前降低（P=0.0005），術(shù)后1m miR-21水平接近正常人水平（P＞0.05）。

表2 各組人群血清miR-21水平（±s）比較

表2 各組人群血清miR-21水平（±s）比較

與正常人比，①P＜0.001；與HCC比，②P＜0.001

2.2 影響肝癌患者血清miR-21水平的因素分析見(jiàn)表3。分析發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清miRNA-21與AFP水平顯著相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)=0.0869，P=0.6794）。

表3 影響HCC患者血清miR-21水平（±s）的因素分析

表3 影響HCC患者血清miR-21水平（±s）的因素分析

①P=0.001；②P=0.002；③P=0.017

3 討論

miRNA與靶基因mRNA 3'非編碼區(qū)的堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，通過(guò)多種方式抑制mRNA的翻譯，從而抑制靶基因的表達(dá)。其主要作用方式有：（1）抑制mRNA起始翻譯；（2）促使多聚核糖體脫落，抑制蛋白翻譯延伸；（3）募集蛋白酶降解翻譯中的蛋白；（4）促進(jìn)mRNA降解。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)靶RNA表達(dá)而發(fā)揮廣泛的生理和病理作用。根據(jù)miRNA功能不同，可以將其分為癌基因和抑癌基因兩類(lèi)。miRNA表達(dá)異常會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功效，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化失去控制，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9，10]。研究表明miR-21在HCC、肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，其在HCC組織中的水平是癌旁組織的近3倍，與HCC患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)（HR=1.6847）[11，12]。miR-21靶基因包括數(shù)種抑癌基因，如p53、PTEN/AKT信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路、FasL和TPM1等，miR-21可抑制靶基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移，起著癌基因的作用。

miR-21序列的增強(qiáng)子區(qū)域存在核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）亞單位p65綁定序列，miR-21是NF-κB的下游靶基因[13]。NF-κB為具生物活性的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控多種信號(hào)途徑。前期研究顯示HCC組織NF-κB過(guò)表達(dá)；在大鼠HCC模型發(fā)現(xiàn)NF-κB表達(dá)隨HCC形成逐漸升高，用NF-κB抑制劑沙利度胺喂飼HCC模型大鼠后可減少或延緩HCC形成。小干擾RNA抑制NF-κB活化，可顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡[14]。作為NF-κB靶基因的miR-21，在NF-κB異?；罨閷?dǎo)下表達(dá)上調(diào)可能在HBV相關(guān)HCC的形成和進(jìn)展中扮演重要角色。

HBsAg陽(yáng)性HCC患者血miR-21水平高于HB-sAg陰性患者，與HBV感染相關(guān)。我國(guó)HCC患者80%左右伴HBV感染或肝炎肝硬化背景，HBx蛋白在誘導(dǎo)HCC形成中扮演重要角色[15，16]。程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。PDCD4 mRNA 3'非編碼區(qū)與miR-21部分序列堿基互補(bǔ)，是miR-21的靶基因，miR-21可下調(diào)PDCD4表達(dá)，HBx通過(guò)上調(diào)miR-21抑制PDCD4表達(dá)，促進(jìn)HCC形成。腫瘤越大，其血清miRNA-21水平越高。細(xì)胞內(nèi)成熟的miRNA被脂蛋白或脂質(zhì)包被成外切酶體，主動(dòng)分泌至胞外進(jìn)入外周血液循環(huán)。當(dāng)HCC組織增大，HCC細(xì)胞數(shù)目增多，其釋放到外周血的miR-21量也增多。較大HCC病灶易出現(xiàn)因病灶生長(zhǎng)過(guò)快致癌組織缺氧導(dǎo)致壞死和凋亡，細(xì)胞破壞，胞內(nèi)物質(zhì)釋放到外周血中增多；伴脈管癌栓患者血清miR-21水平較無(wú)脈管癌栓者高，癌栓主體為癌細(xì)胞，提示腫瘤細(xì)胞脫落原發(fā)灶入血液循環(huán)，其釋放miR-21直接到外周血，致血miR-21水平升高。

miRNA在外周血中可以穩(wěn)定存在，耐RNA酶降解。本文顯示HCC患者術(shù)后一周其血清miR-21水平較術(shù)前無(wú)明顯降低，表明miR-21在血清中半衰期較長(zhǎng)。術(shù)后一月其水平較術(shù)前有明顯降低，提示術(shù)后檢測(cè)患者血清miR-21來(lái)推測(cè)患者復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時(shí)間窗應(yīng)該在一月或更晚之后。

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（收稿：2013-07-11）

（校對(duì)：陳從新）

Serumlevel of microRNA-21 in patients with hepatocellular carcinoma

Hao Qingya，Wang Yilang，Yao Dengfu，et al.
First People’s Hospital，Natong 226001，Jiangsu Province，China

ObjectiveTo evaluate serum level of microRNA-21（miR-21）in normal persons and patients with different liver diseases，and to investigate its effect in the diagnosis of hepatocellular carcinoma（HCC）. MethodsThe serum level of miR-21 in healthy controls（n=25），patients with chronic hepatitis B（CHB，n=25），cirrhosis（n=25），and HCC（n=25）were measured by real-time quantitative RT-PCR.The relationships between serum miR-21 levels and clinical pathological features of HCC were also investigated.ResultsThe relative serum levels of miR-21 in normal controls，CHB and cirrhotic patients were（1.1±1.7），（2.3±2.6）and（2.8±2.5），respectively，all of which were significantly lower than that in HCC patients（22.6±4.4），P＜0.001；The relative serum levels of miR-21 in HCC patients one week and one month after surgery were（18.4±3.5）and（3.1±2.7），respectively，significantly lower than that before operation（22.6±4.4），P＜0.001；Serum levels of miR-21 were correlated with tumor size，tumor thrombosis and HBV infection，but not with tumor numbers，tumor differentiation and serum AFP levels. ConclusionsSerum levels of miR-21 is elevated in HCC patients and might be used as a potential biomarker for the early diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma；MicroRNA-21；Serum；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.020

國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)（2013DFA32150）；南通市科技計(jì)劃項(xiàng)目（S11904/K2010026）

226001江蘇省南通市第一人民醫(yī)院肝膽外科（郝清亞）；腫瘤科（王以浪，繆亞軍，印滇）；南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心（姚登福）

郝清亞，男，31歲，醫(yī)學(xué)碩士，住院醫(yī)師。主要從事肝癌的分子診斷學(xué)研究。E-mail：895325173@qq.com

王以浪，E-mail：oncowang@163.com