王 波，唐曉鵬

·急性肝損傷·

臍血干細胞與骨髓干細胞聯(lián)合移植治療大鼠急性肝衰竭實驗研究

王 波，唐曉鵬

目的觀察臍血干細胞和自體骨髓干細胞共同移植治療D-半乳糖苷所致急性肝衰竭大鼠的療效。方法采集大鼠臍血和骨髓中單個核細胞，以促肝細胞生長因子和干細胞因子培養(yǎng)3w，采用免疫細胞化學法檢測白蛋白和甲胎蛋白表達情況；以D-半乳糖苷腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型，24 h后每日經(jīng)鼠尾靜脈分別注入臍血干細胞，或骨髓干細胞，或混合的臍血干細胞和骨髓干細胞，對照組注射等量生理鹽水，治療7d，觀察4組大鼠存活率、肝功能和肝組織病理學變化。結果在促肝細胞生長因子及干細胞因子的誘導下，臍血干細胞和骨髓干細胞可以在體外擴增并分化為肝細胞；臍血干細胞移植、骨髓干細胞移植和聯(lián)合細胞移植組大鼠9d存活率分別為55.6%、50.0%和77.8%，均明顯高于生理鹽水對照組（16.7%，P＜0.01）；聯(lián)合移植組存活率高于任何一種單純干細胞移植（P＜0.01）。結論臍血干細胞和骨髓干細胞移植對大鼠急性肝損傷有一定的保護作用，兩者聯(lián)合移植有協(xié)同作用。

急性肝衰竭；干細胞；細胞移植；臍血干細胞；骨髓干細胞

干細胞具有多向分化能力[1]，在一定的條件下可以分化為心肌細胞、血細胞、神經(jīng)元、肌肉細胞和肝細胞等[2]。臍血干細胞（Umbilical cord blood stem cell，UCBSC）和骨髓干細胞（Bone marrow stem cell，BMSC）在含重組人肝細胞生長因子等的培養(yǎng)基中可以表達白蛋白[3]。臨床觀察顯示UCBSC移植治療肝衰竭患者具有較好的療效[4]，但臍血中干細胞含量較少，不易種植，而成年BMSC增殖分化能力不如UCBSC強，且肝衰竭病人有嚴重的出血傾向，抵抗力減低，反復采集BMSC易導致出血和感染等并發(fā)癥。在本實驗，我們應用UCBSC與BMSC聯(lián)合移植治療肝衰竭大鼠，以增強其治療效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與實驗材料用于采集BMSC的健康雄性SD大鼠4只（體質(zhì)量100～150 g，鼠齡3～4w）和用于采集UCBSC的出生1d內(nèi)的新生SD大鼠10只，均由湖南省人民醫(yī)院動物實驗室提供。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；干細胞因子（Stem cell factor，SCF）及促肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）均為美國Preprotech公司產(chǎn)品；PAS染色試劑盒為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒系北京中杉金橋產(chǎn)品；淋巴細胞分離液（Ficoll）系上海恒信化學試劑有限公司產(chǎn)品；鼠抗大鼠ALB多克隆抗體為北京中杉金橋產(chǎn)品，用前用抗體稀釋液配成實驗所需濃度（1∶200）；鼠抗大鼠AFP多克隆抗體（即用型）系北京中杉金橋產(chǎn)品。

1.2 干細胞分離與培養(yǎng)將新生的大鼠斷頭，取血用于分離UCBSC；將成年大鼠處死，無菌條件下取出股骨，沖洗骨髓腔，先后用7號及4號針頭過濾骨髓沖洗液，用于分離BMSC。在50 ml無菌離心管中加入淋巴細胞分離液（比重1.077）15 ml，沿管壁緩慢加入新生鼠血液或成年鼠骨髓細胞（用DMEM按1∶1稀釋）30ml。離心收集離心管中白膜層細胞（單個核細胞）。將細胞稀釋至1×106個/ml。置含15%胎牛血清、HGF10ng/ml、SCF20ng/ml、谷氨酰氨2 mmol/l、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。原代細胞生長至30d左右，生長良好的細胞可見集落形成并開始融合，當融合達80%時，用新鮮配制的0.25%胰酶消化細胞進行傳代。

1.3 細胞白蛋白及甲胎蛋白表達的檢測在細胞培養(yǎng)至21d時，用0.25%胰蛋白酶消化，取UCBSC或BMSC，將其接種到用多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，行免疫組化檢測。用4%多聚甲醛固定15～20 min，PBS沖洗1次/3min×3次。加過氧化物酶阻斷液在室溫下作用10 min，PBS沖洗1次/3min×3次。室溫下加正常非免疫動物血清封閉10 min。甩棄多余的血清，加抗AFP（即用型）或抗ALB（1∶200），4℃過夜。PBS沖洗1次/3min×3次加生物素標記的抗鼠IgG抗體，室溫下孵育15 min，DAB顯色，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，終止顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 細胞糖原染色采用PAS染色，取培養(yǎng)至第21天的細胞進行細胞涂片，用95%酒精固定。1%高碘酸水溶液浸10～15 min，蒸餾水洗數(shù)次；放入Schiff氏液作用30 min，自來水充分沖洗約5 min，復染，用Harris氏蘇木素復染1～3 min，或用2%甲綠復染15 min，使核著色，自來水沖洗，晾干。在顯微鏡下觀察。

1.5 細胞移植治療急性肝衰竭大鼠取D-gal，按1.4g· kg-1給80只雄性大鼠（體質(zhì)量100～150 g，鼠齡3～4w）行一次性腹腔注射，建立大鼠急性肝衰竭模型。建模24h內(nèi)大鼠死亡8只。將存活的72只大鼠隨機分成4組，每組18只。取UCBSC、BMSC或混合后的UCBSC和BMSC（各50%）106細胞，加入NS 0.8 ml，尾靜脈注射，1次/d，×7d。在建模后第1、3、6和9 d取血，檢測肝功能，分批取肝組織行病理學檢查。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包，各組生化數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間均數(shù)比較采用ANOVA法，P＜0.05被認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 臍血單個核細胞培養(yǎng)情況原代培養(yǎng)的細胞生長緩慢，大約2w后開始形成集落，4w左右細胞生長達大約80%融合。消化傳代后的細胞呈梭形、圓形、類圓形及多邊形。

2.2 BMSC培養(yǎng)情況培養(yǎng)72h后，貼壁生長的BMSC數(shù)量稀少，散在，多呈細而小梭形。2w左右細胞達80%融合，呈均一的長梭形。傳代培養(yǎng)的BMSC未見明顯的形態(tài)改變。

2.3 培養(yǎng)細胞ALB、AFP表達和糖原顆粒情況UCBSC和成年BMSC在HGF和SCF的誘導下，細胞漿ALB和AFP陽性（圖1～4），并且在細胞胞漿中出現(xiàn)了大小不等的紅染糖原顆粒（圖5、6），推測這些細胞極有可能就是肝細胞。

2.4 各組大鼠成活情況比較見表1。

圖1 UCBSC表達ALB在UCBSC中可見ALB表達（免疫組化染色，400×）

圖2 BMSC表達ALB在BMSC中可見ALB表達（免疫組化染色，200×）

圖3 UCBSC表達AFP在UCBSC中可見AFP表達（免疫組化染色，100×）

圖4 BMSC表達AFP在BMSC中可見AFP表達（免疫組化染色，100×）

圖5 UCBSC糖原顆粒陽性在培養(yǎng)第21 d，UCBSC中可見糖原顆粒（PAS染色，400×）

圖6 BMSC糖原顆粒陽性在培養(yǎng)第21 d，BMSC中可見糖原顆粒（PAS染色，400×）

表1 各組大鼠成活率（%）的比較

2.5 大鼠肝功能變化的比較見表2。

表2 不同治療對大鼠肝功能（±s）的影響

表2 不同治療對大鼠肝功能（±s）的影響

與生理鹽水組比，①P＜0.05；與UCBSC或BMSC組比，②P＜0.05

2.6 各組大鼠肝組織病理學改變比較見圖7～9。

圖7 BMSC治療后7 d肝組織病理學表現(xiàn)（HE，100×）

圖8 UCBSC治療后7 d肝組織病理學表現(xiàn)（HE，100×）

圖9 UCBSC與BMSC聯(lián)合移植治療后7 d肝組織病理學表現(xiàn)（HE，100×）

3 討論

臍帶血具有某些生物學特性，其中UCBSC含有造血干細胞/祖細胞，且原始造血細胞的數(shù)量以及增殖分化能力、體外集落形成能力、被刺激后進入細胞周期的速度和自泌生長因子的能力等均強于骨髓及外周血干細胞。早在1974年就發(fā)現(xiàn)臍帶血中含有造血干細胞。造血干細胞有兩個基本特性：（1）高度的自我更新能力或自我復制能力，這樣可以保持干細胞數(shù)量恒定；（2）進一步分化為各系祖細胞及成熟血細胞的能力，這是造血干細胞生命意義的體現(xiàn)。

臍血中T淋巴細胞比較原始，缺乏T淋巴細胞活化P生長因子，抗原表達弱而不充分，自然殺傷細胞（NK）活性也較弱。因此，淋巴細胞的細胞毒性較低，免疫系統(tǒng)很不成熟，發(fā)生排斥反應少，在一般情況下不會引起嚴重的抗宿主反應。臍血中含有間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），具有多向分化的能力[5]。Kakinuma[3]等在體外用FGF-1、FGF-2、LIF、SCF等細胞因子誘導臍帶血細胞向肝細胞分化，發(fā)現(xiàn)誘導21d后，50%細胞開始表達白蛋白，而且這種細胞在體外具有增殖能力。Aurich等[6]將UCBSC與生長因子共同培養(yǎng)至21d后證實了其糖原存儲和尿素合成等體外功能標志，將培養(yǎng)的肝樣細胞移植入免疫衰竭的小鼠肝內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細胞繼續(xù)表達糖原存儲、白蛋白和人肝細胞特殊抗原，提示UCBSC體外培養(yǎng)可分化為肝細胞；在體內(nèi)移植后，繼續(xù)保持肝細胞特性。Danet[7]等首次將從臍血中分離、純化的500～1500 Lin-CD38-CD34+CiqRP+或7000～8000個Lin-CD38-CD34-CiqRP+細胞移植給亞致死劑量放射線照射的免疫缺陷鼠，在8～12 w后，可以在鼠肝臟中檢測到人肝細胞存在，證實HUCBSC可以在免疫缺陷大鼠體內(nèi)分化為肝細胞。

BMSC在特定條件下能分化成為各種血液及骨髓細胞，主要有造血干細胞、間充質(zhì)干細胞和骨髓源肝干細胞。大量研究證明，這三類細胞都具有向肝細胞分化的潛能。多項研究相繼證實在骨髓移植和肝臟移植病人的肝臟中有來源于骨髓的肝細胞[8，9]。體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化實驗表明，骨髓間充質(zhì)細胞在向肝細胞分化過程中，其形態(tài)發(fā)生漸進性變化，由成纖維樣細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?，越來越接近肝細胞的形態(tài)特征，說明在誘導條件下骨髓間質(zhì)細胞已發(fā)生了本質(zhì)的變化，已具有幼稚肝細胞的特征，已開始向肝細胞分化[10]。大量研究表明動物和人的骨髓中存在多向分化潛能的干細胞，這些干細胞在體內(nèi)外均可誘導分化為功能完備的肝細胞，經(jīng)人為誘導培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞在體外能定向分化為肝細胞樣細胞，經(jīng)誘導后的骨髓間充質(zhì)干細胞上有了成熟肝細胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓間充質(zhì)干細胞可作為肝細胞移植的新型種子細胞[11，12]。Oh等[13]發(fā)現(xiàn)HGF通過c-Met受體誘導成體骨髓細胞表達ALB和AFP。Theise等報道[14]骨髓細胞在體內(nèi)不但能分化為肝細胞，而且能分化為膽管細胞。季鳳清[15]等報道人臍血非造血干細胞無論原代、傳代細胞、分化細胞及IFN-γ處理的細胞，其免疫原性均較弱，不易產(chǎn)生排異反應。UCBSC分化及增殖能力均較強。

[1]Laurson J，Selden C，Hodgson HJ.Hepatocyte progenitors in man and in rodents—multiple path ways，multiple candidates. Int J Exp Pathol，2005，86（1）：1-18.

[2]Navarro-MonteroO，Romero-MoyaD，MontesR，etal. Intrahepatic transplantation of cord blood CD34+cells into newborn NOD/SCID-IL2Rγ（null）mice allows efficient multiorganandmulti-lineagehematopoieticengraftmentwithout accessory cells.Clin Immunol，2012，145（2）：89-91.

[3]Kakinuma S，Tanaka Y，Chinzei R，et al.Human umbilical cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem Cells，2003，21：217-227.

[4]Tang XP，Yang X，Tan H，et al.Clinical and experimental study on therapeutic effect of umbilical cord blood transplantation on severe viral hepatitis.World J Gastroenterol，2003，9：1999-2003.

[5]LeeHJ，JungJ，ChoKJ，etal.Comparisonofinvitro hepatogenic differentiation potential between various placentaderived stem cells and other adult stem cells as an alternative source of functional hepatocytes.Differentiation，2012，84（3）：223-231.

[6]Aurich I，Mueller LP，Aurich H，et al.Functional integration of hepatocytes derived from human mesenchymal stem cells into mouse livers.Gut，2007，56（3）：405-415.

[7]Danet GH，Luongo JL，Bulter G，et al.CiqRp defines a new human stem cell population with hematopoitic and hepatic potential.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（16）：10441-10445.

[8]AlisonMR，PoulsomR，JefferyR，etal.Hepatoeytesfrom nonhepatie adult stem cells.Nature，2000，406：257-261.

[9]Theise ND，Nimmakayalu M，Gardner R，et al.Liver from bone marrow in humans.Hepatology，2000，32（1）：11-16.

[10]Theise ND，Badve S，Saxane R，et al.Derivation of hepatocytes frombonemarrowcellsinmiceafterradiationinduced myelablation.Hepatology，2000，31（1）：235-240.

[11]Kang XQ.Fibroblast growth factor-4 and hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord bloodderivedmesenchymalstemcellsintohepatocytes.WorldJ Gastroenterol，2005，11（47），7461-7465.

[12]李文晰，段芳齡.人骨髓單個核細胞向肝細胞誘導分化的體外研究.胃腸病學和肝臟病學雜志，2004，12（2）：144-147.

[13]Oh SH，Miyazaki M，Kouchi H，et al.Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocytelineageinvitro.BiochemBiophysResCommun，2000，279：500-504.

[14]Theise ND，Badve S，Saxena R，et al.Derivation of hepatocytes frombonemorrowcellsinmiceafterradiation-induced myeloablation.Hepatology，2000，31：235-224.

[15]季鳳清，王屹，孫海梅，等.人臍血非造血干細胞免疫原性的實驗研究.解剖學報，2008，39（1）：55-59.

（收稿：2013-05-08）

（校對：陳從新）

Experimental study of transplantations of umbilical cord blood stem cells combined with bone marrow stem cells for rats with acute liver failure

Wang Bo，Tang Xiaopeng.
Liver Diseases Center，Second Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410011，China

ObjectiveTo observe the therapeutic effects of co-transplanted umbilical cord blood stem cells and bone marrow stem cells for rats with acute liver failure induced by D-galactose.MethodsMononuclear cells isolated from umbilical cord blood and bone marrow of rats were cultured in medium containing hepatocyte growth factor（HGF）and stem cell factor（SCF）for 3 weeks，and the expression of hepatocyte markers，such as AFP and ALB，were detected by immunocytochemistry；A rat model of acute liver failure was established by D-galactose injection（1.4 g.kg-1，intraperitoneally）for 24 h.Rats with acute liver failure were subjected to transplantation of bone marrow stem cells，umbilical cord blood stem cells，and umbilical cord blood stem cell mixed with bone marrow stem cell，or an equal amount of saline per day for seven days.The survival rates，liver function and pathological changes in liver were studied.ResultsBone marrow stem cells and umbilical cord blood stem cells were successfully proliferated anddifferentiated into hepatocytes in vitro by stimulation of HGF and SCF.The 9-day survival rates of rats with acute liver failure in umbilical cord blood stem cell，bone marrow stem cell and mixed stem cell transplantation group were 55.6%，50.0%and 77.8%，respectively，all of which were markedly higher than that in rats treated with saline（16.7%，P＜0.01）；The 9-day survival rate of rats in mixed cell transplantation group was significantly higher than that of rats in umbilical cord blood stem cell or bone marrow stem cell alone（P＜0.01）. ConclusionsBone marrow stem cell and umbilical cord blood stem cell transplantation improve liver function of rats with acute liver failure，and combinational transplantation of these two cells is efficient.

Acute liver failure；Stem cell；Cell transplantation；Bone marrow stem cell；Umbilical cord blood stem cell；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.017

410011長沙市中南大學湘雅二醫(yī)院肝病中心/肝病研究所

王波，男，30歲，醫(yī)學碩士，醫(yī)師

唐曉鵬，E-mail：xiaopeng1959@163.com