代雪楓，馬 勇，徐長江，王 莉

·病毒性肝炎·

慢性HBV攜帶者肝組織Fas和Fas配體表達(dá)變化及其意義

代雪楓，馬 勇，徐長江，王 莉

目的觀察慢性HBV攜帶者（chronic asymptomatic HBV carrier，ASC）肝組織Fas和Fas配體（FasL）的表達(dá)和血清可溶性Fas（sFas）水平的變化。方法對120例ASC行肝穿刺，采用免疫組織化學(xué)法檢測肝組織Fas和FasL表達(dá)，采用ELISA法檢測血清sFas水平。結(jié)果120例ASC肝組織完全正常者僅占11%，輕度肝炎占59%，而中、重度肝炎占30%；表現(xiàn)正常的肝組織無Fas和FasL表達(dá)，輕度肝炎肝組織多無表達(dá)或僅限于界面炎癥區(qū)的肝細(xì)胞及淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)，而中、重度肝炎肝組織Fas和FasL多為陽性，F(xiàn)as強(qiáng)陽性率分別達(dá)34.8%和69.2%，F(xiàn)asL強(qiáng)陽性率分別達(dá)30.4%和53.8%，均明顯高于正常組和輕度炎癥組（P＜0.05），同時(shí)中、重度肝炎組間也存在顯著性差異（P＜0.05），其分布除界面炎癥區(qū)外，肝小葉中也彌漫分布；肝組織表現(xiàn)正常的ASC血清sFas水平為（1.68±0.33）ng/L，而輕、中、重度肝炎患者則分別為（2.58±0.31）ng/L、（3.94±0.21）ng/L和（5.94±0.26）ng/L，均較正常組顯著升高（F=218.01，P＜0.01），各組間sFas水平也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。結(jié)論Fas和FasL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在慢性HBV攜帶者肝組織病變中可能起到了重要作用。

慢性HBV攜帶者；凋亡；Fas；Fas配體

大部分慢性HBV感染者是慢性HBV攜帶者（chonic asymptomatic HBV carrier，ASC）。部分ASC人群在肝功能持續(xù)正常多年后也會(huì)進(jìn)展至肝硬化甚至肝癌[1，2]。因此，雖然ASC血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)正常，而肝組織學(xué)卻并非完全靜止[3]，部分人群也會(huì)存在較重的肝組織損害。Fas-FasL是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對跨膜蛋白。我們選取120例ASC行肝組織活檢，檢測了Fas-FasL表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 病例來源選取2010年9月到2012年10月在本院肝病中心就診的120例ASC，男68例，女52例；年齡18～49歲，平均年齡（38.5±5.8）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg和HBV DNA持續(xù)陽性超過6月以上，無肝病相關(guān)癥狀和體征，1年內(nèi)隨訪3次以上，血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)正常。排除其他肝炎病毒感染和/或艾滋病病毒重疊感染，無自身免疫性肝病、藥物性肝損害及長期酗酒史。

1.2 肝活檢在超聲引導(dǎo)下，以16G肝穿針穿刺，連續(xù)獲取肝組織兩條，常規(guī)行病理學(xué)檢查。依據(jù)2000年發(fā)布的《病毒性肝炎防治方案》[4]關(guān)于慢性肝炎分級分期的標(biāo)準(zhǔn)，炎癥分為4級（G0～4），纖維化分為4期（S0～4）。根據(jù)肝穿刺病理學(xué)檢查結(jié)果，將ASC分為3組：即輕度（G1～2S0～2）；中度（G3S1～3）和重度（G4S2～4）。

1.3 肝組織Fas/FasL表達(dá)的檢測采用SP法，兔抗Fas及抗FasL單克隆抗體（1：100）、正常羊血清、羊抗多價(jià)生物素和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素試劑均購自北京中山公司。結(jié)果判斷：細(xì)胞漿及細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色、棕黃色或棕褐色顆粒物為陽性細(xì)胞。在普通光鏡下每片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，在每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。（-）為無明顯細(xì)胞著色或少量細(xì)胞呈淡黃色染色；（+）為10%～30%細(xì)胞陽性；（++）為大于30%細(xì)胞陽性。

1.4 血清sFas水平檢測采用ELISA法檢測（試劑盒為北京中山生物有限公司提供）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用x2檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Fas和FasL表達(dá)情況正常組肝組織基本無陽性表達(dá)，而輕度肝炎組以無表達(dá)或陽性表達(dá)為主，且陽性表達(dá)僅見于界面炎癥區(qū)的肝細(xì)胞及淋巴細(xì)胞；中、重度肝炎組則出現(xiàn)Fas和FasL陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，無陰性表達(dá)，除界面炎癥區(qū)外，肝小葉中也有彌漫陽性物質(zhì)分布，肝竇壁內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞、炎癥區(qū)的梭形細(xì)胞等均有表達(dá)（圖1、2、3、4）。隨著炎癥程度加重，肝組織Fas和FasL的表達(dá)明顯增強(qiáng)。中、重度肝炎患者肝組織Fas強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為34.8%和69.2%，F(xiàn)asL強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為30.4%和53.8%，均明顯高于正常組和輕度肝炎組（P＜0.05，表1）。

表1 各組肝細(xì)胞Fas和FasL表達(dá)的比較

圖1 輕度肝炎患者肝組織Fas表達(dá)情況在匯管區(qū)周圍有陽性表達(dá)（SP，200×）

圖2 重度肝炎患者肝組織Fas陽性表達(dá)（SP，200×）

圖3 重度肝炎患者肝組織FasL表達(dá)情況肝細(xì)胞內(nèi)呈顆粒狀表達(dá)（SP，200×）

圖4 中度肝炎患者肝組織FasL表達(dá)情況在肝小葉內(nèi)呈灶狀陽性（SP，200×）

2.2 血清sFas水平正常組血清sFas水平為（1.68± 0.33）ng/L，而輕、中和重度組分別為（2.58±0.31）ng/L、（3.94±0.21）ng/L和（5.94±0.26）ng/L，各與正常組比均顯著升高（F=218.01，P＜0.01），重度肝炎患者血清sFas水平也顯著高于輕中度患者。

3 討論

HBV感染是肝硬化和原發(fā)性肝癌最主要的病因。慢性HBV攜帶者是指HBsAg和HBV DNA持續(xù)陽性超過6月以上，無肝病相關(guān)癥狀和體征，1年內(nèi)隨訪3次以上，血清轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)正常者[5]。ASC在漫長的感染過程中多數(shù)逐漸清除病毒后肝臟并無損害表現(xiàn)，但也有部分患者肝功能持續(xù)正常多年后會(huì)進(jìn)展至肝硬化甚至肝癌[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，對ASC患者進(jìn)行肝組織活檢，僅有10%完全正常，輕微病變占11%～48%，其它則表現(xiàn)為慢性肝炎甚至肝硬化[7]。我們選取120例慢性HBV攜帶者進(jìn)行肝組織活檢，發(fā)現(xiàn)肝組織完全正常者僅占11%，輕度肝炎占59%，而中、重度肝炎占30%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

ASC與慢性乙型肝炎患者在臨床上的主要區(qū)別在于：慢性肝炎有明顯的肝病癥狀及反復(fù)肝功能異常，即血清ALT和AST有明顯升高，ASC則長期肝功能正常。那么，為何部分ASC患者肝功能長期正常，但肝組織病變?nèi)詴?huì)進(jìn)展呢？HBV感染導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡可作為一種較好的解釋。既往都認(rèn)為在HBV感染過程中，肝炎病毒感染的肝細(xì)胞由主要組織相容性復(fù)合物（MHC）－Ⅰ類抗原限制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）特異性識別并通過細(xì)胞溶解作用即細(xì)胞壞死途徑將其破壞，從而在清除病毒的同時(shí)也引起肝細(xì)胞的免疫損傷[8～10]。但最近研究發(fā)現(xiàn)，MHC－Ⅰ類抗原限制的CTL還可以非細(xì)胞溶解機(jī)制，即凋亡的形式來清除病毒及受染細(xì)胞，凋亡細(xì)胞碎裂為一些胞膜包裹的小體即凋亡小體，凋亡時(shí)肝細(xì)胞膜完整，細(xì)胞內(nèi)容物無泄漏，因此ALT和AST等酶類未釋放到血中，也不會(huì)檢測到外周血酶學(xué)指標(biāo)的升高，而大量凋亡小體可使庫普弗細(xì)胞活化，分泌大量的細(xì)胞因子，從而激活肝星狀細(xì)胞（HSC），分泌大量的ECM，引起肝纖維化甚至肝硬化[11～14]。

Fas和FasL是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對跨膜蛋白，F(xiàn)asL被稱為死亡因子，F(xiàn)as與FasL結(jié)合，導(dǎo)致蛋白酶促級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，引起DNA斷裂，染色體濃縮，引起細(xì)胞凋亡[15～18]。血清sFas是Fas基因轉(zhuǎn)錄過程中不同拼接所致跨膜蛋白缺乏的產(chǎn)物或Fas抗原被清除過程中的游離產(chǎn)物。因此，血清sFas可能是細(xì)胞Fas分子的胞外部分被水解后形成的。血清sFas可以作為細(xì)胞凋亡的預(yù)測因素。在乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程中，CTL可通過FasL與被感染的肝細(xì)胞上表達(dá)的Fas結(jié)合，介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[19，20]。血清sFas對細(xì)胞凋亡可能起重要的調(diào)節(jié)作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)ASC患者肝組織Fas和FasL主要表達(dá)于肝細(xì)胞膜及胞漿中，表達(dá)程度隨炎癥活動(dòng)度加重而增強(qiáng)，尤其在匯管區(qū)周圍及周邊小葉更明顯，正常組基本無表達(dá)，而輕度組以無表達(dá)或陽性表達(dá)為主，僅見于界面區(qū)的肝細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上；中、重度肝炎組則均有Fas和FasL的陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)，無陰性表達(dá)，除界面炎癥區(qū)外，肝小葉中也彌漫分布，肝竇壁內(nèi)皮細(xì)胞、膽管細(xì)胞等均有表達(dá)。以上的研究顯示反映凋亡的Fas-FasL的表達(dá)均隨著肝組織炎癥程度加重而增強(qiáng)，提示慢性HBV攜帶者肝組織炎癥與凋亡密切相關(guān)，我們推測凋亡可以在沒有明顯肝臟酶譜升高的情況下引起肝組織的損傷及纖維化，這種變化可能是一個(gè)長期的過程，最終也可導(dǎo)致較重的肝纖維化，甚至肝硬化。

[1]張立潔，王欣欣，孟忻.慢性HBsAg攜帶者及非活動(dòng)性HBV感染狀態(tài)的病理學(xué)研究.臨床肝膽病雜志，2007，23（5）：337-339.

[2]劉耕陶，斯崇文，王勤環(huán).對我國慢性病毒性肝炎防治與研究工作的建議.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，82（2）：13-18.

[3]Liaw YF.Natural history of chronic hepatitis B infection and long-term outcome under treatment.Liver Int，2009，29（suppl1）：100-107.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì)．病毒性肝炎防治方案．中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329．

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.實(shí)用肝臟病雜志，2011，14（2）：81-89.

[6]葉立紅，梅志勤，劉彥超，等.162例慢性HBV攜帶者HBV DNA載量與肝組織炎癥壞死程度的相關(guān)性.臨床肝膽病雜志，2007，23（5）：27-32.

[7]張小東.淺談乙肝表面抗原攜帶者的診療及預(yù)后.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，15（3）：411-412.

[8]Zhang M，He W，Liu F，et al.Inhibition of mouse hepatocyte apoptosis viaanti-Fas ribozyme.World J Gastroenterol，2004，10（17）：412-418.

[9]Choudhury JA，Ruessel CL，Randhaws S，et al.Differential induction of nuclear Factor-KB and activator protein-1 activity after CD40 ligation is associated with primary human hepatocyte apoptosis or intrahepatic endothelial cell proliferation.Mol Boil Cell，2003，44：1334-1341.

[10]Ockner RK.Apoptosis and liver disease：recent concepts of mechanism and significance.J Gastroenterol Hepatol，2001，16：248-260.

[11]馬清峰，王威.慢性乙型肝炎患者IL-18、Fas檢測的臨床意義.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（7）：1181-1182.

[12]宋修光，馬立憲.乙型肝炎患者肝細(xì)胞Fas和血清可溶性s Fas與肝臟損傷的關(guān)系.臨床檢驗(yàn)雜志，2007，25（1）：32-33.

[13]盛云建，宋新文.慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)和凋亡的檢測及意義.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2008，11（3）：317-318.

[14]邢文斌，劉麗娜，呂申.Fas、FasL在慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞上的表達(dá).臨床肝膽病雜志，2007，23（1）：11-13.

[15]Jun EJ，Han JY，Sun HS.Clinical significances of serum soluble fas and soluble fas ligand in chronic hepatitis B.Korean J Hepatol，2006，12（4）:507-514.

[16]Lapinski TW.The concentration of Fas in the serum and liver tissueinviralchronichepatitisBpatientstreatedwith lamivudine.Hepatogastroenterology，2005，52（62）:575-579.

[17]Oksuz M，Akkiz H，Isiksal YF，et al.Expression of Fas antigen in liver tissue of patients with chronic hepatitis B and C.Eur J Gastroenterol Hepatol，2004，16（3）:341-345.

[18]Song le H，Binh VQ，Duy DN，et al.Variations in the serum concentrations of soluble Fas and soluble Fas ligand in Vietnamese patients infected with hepatitis B virus.J Med Virol，2004，73（2）:244-249.

[19]Lee JY，Chae DW，Kim SM，et al.Expression of FasL and perforin/granzyme B mRNA in chronic hepatitis B virus infection.J Viral Hepat，2004，11（2）:130-135.

[20]Jung YJ，Kim YJ，Kim LH，et al.Putative association of Fas and FasL gene polymorphisms with clinical outcomes of hepatitis B virus infection.Intervirology，2007，50（5）:369-376.

（收稿：2013-09-03）

（校對：陳從新）

Expression of Fas and Fas ligand in liver tissues from chronic asymptomatic hepatitis B virus carriers

Dai Xuefeng，Ma Yong，Xu Changjiang，et al.
Center for LiverDisease，123rdHospital，Bengbu233015，Anhui Province，China

ObjectiveTo investigate the expression of Fas antigen and Fas ligand（FasL）in liver tissues from chronic asymptomatic hepatitis B virus（HBV）carrier（ASC）.MethodsLiver biopsy specimen and sera from 120 individuals with ASC were obtained；The expression of Fas and FasL in liver tissues were detected by immunohistostaining.Serum levels of soluble Fas（sFas）and sFasL were measured by ELISA.ResultsOnly 11% had a normal appearance of liver tissues in the 120 chronic HBV carriers，and 59%had mild and other 30%had moderate to severe hepatitis；Fas and FasL were negative in normal liver tissues，almost absent or only slightly positive in hepatocytes and lymphocytes in inflammatory zone of the interface in liver tissues with mild hepatitis，and strongly positive in those with moderate or severe hepatitis，showing a pattern of diffused staining in the interface area of hepatic lobules；The strongly positive rate for Fas and FasL in moderate（34.8%and 30.4%，respectively）and severe hepatitis（69.2%and 53.8%，respectively）was significantly higher than that in mild hepatitis or normal liver tissues（P＜0.05）；Serum sFas from persons with normal liver tissues was（1.68±0.33）ng/L，and they increased significantly to（2.58±0.31）ng/L，（3.94±0.21）ng/L and（5.94±0.26）ng/L，respectively，from individuals with mild，moderate and severe hepatitis（P＜0.01）.ConclusionThe Fas-FasL mediated apoptosis might play an important role in the disease progress of ASC.

Chronic asymptomatic hepatitis B virus carrier；Apoptosis；Fas；Fas ligand

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.015

233015安徽省蚌埠市解放軍第123醫(yī)院肝病中心

代雪楓，女，39歲，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎及脂肪性肝炎的診斷與治療研究。E-mail：daisnowfe@163. com