李 平，楊志國，張 馨，常靜霞，高 蕾，汪茂榮

·病毒性肝炎·

逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)A181T/V和A181T/V+N236T變異的乙型肝炎病毒感染者臨床特征分析*

李 平，楊志國，張 馨，常靜霞，高 蕾，汪茂榮

目的比較逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)A181T/V變異與A181T/V+N236T變異的乙型肝炎病毒感染者臨床特征的異同。方法對55例發(fā)生rtA181T/V單獨變異和34例發(fā)生rtA181T/V+rtN236T聯(lián)合變異的乙型肝炎病毒感染者既往核苷（酸）類似物治療情況進(jìn)行回顧，對耐藥時谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、HBV M、HBV DNA等指標(biāo)進(jìn)行檢測，并根據(jù)耐藥測序結(jié)果確定病毒的基因型。結(jié)果阿德福韋單藥治療患者發(fā)生A181T/V+N236T變異較A181T/V變異的比例高（57.6%對42.4%，P＜0.05），而拉米夫定換用（或加用）阿德福韋治療患者發(fā)生A181T/V變異較A181T/V+N236T變異的比例高（75.5%對24.5%，P＜0.05）；在89例患者中B基因型和C基因型分別是14例和75例，不同變異在B或C基因型中的分布無統(tǒng)計學(xué)差異；A181T/V變異與A181T/V+N236T變異相比，兩組患者的年齡、性別構(gòu)成、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、HBV DNA、HBsAg定量、HBeAg狀態(tài)等指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論不同的核苷（酸）類似物治療可導(dǎo)致A181T/V變異和A181T/V+N236T變異模式的差異，但這兩種變異感染者臨床指標(biāo)無明顯差異。

乙型肝炎；乙型肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)；核苷類耐藥；變異

核苷（酸）類似物【Nucleos（t）ide analogues，NAs】是目前治療慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）的重要藥物，但隨著治療時間的延長，乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）可出現(xiàn)耐藥變異，造成抗病毒治療的失敗，加劇病情的進(jìn)展。HBV逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcriptase，RT）區(qū)A181是一個特殊的耐藥變異位點，其變異后可引起患者對大部分NAs的治療敏感性下降[1]。有文獻(xiàn)認(rèn)為，rtA181T/V變異常常與rtN236T變異同時存在[2]。為進(jìn)一步探討這兩種變異的臨床特征及與抗病毒治療的關(guān)系，我們對55例發(fā)生rtA181T/V單獨變異和34例rtA181T/V+rtN236T聯(lián)合變異患者的治療情況進(jìn)行了回顧分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源2010年1月～2012年5月我院收治的慢性乙型肝炎患者89例，男性82例，女性7例，平均年齡（41.1±10.6）歲。診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受NAs抗病毒治療6 m以上，每3～6 m復(fù)查一次，出現(xiàn)病毒突破（HBV DNA大于500copies/mL），且耐藥檢測提示rtA181T/V或rtA181T/V+rtN236T變異。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并丙型肝炎、藥物性肝損傷和自身免疫性肝病等。

1.2 常規(guī)檢測采用奧林巴斯AU5400生化分析儀及相關(guān)試劑檢測血液生化指標(biāo)；采用Roche公司的Elecsys 2010儀器和配套試劑檢測HBV M；使用ABI 7300熒光定量PCR儀檢測HBV DNA（上海科華生物工程股份有限公司）。

1.3 耐藥位點檢測對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序法，按試劑盒說明提取血清病毒DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增RT區(qū)基因，擴(kuò)增引物見表1。P1、P2擴(kuò)增第一輪，P3、P4擴(kuò)增第二輪。條件均為：95℃2 min后，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后由ABI 3730XL進(jìn)行測序。結(jié)果經(jīng)MEGA4比對后，參照文獻(xiàn)[4]對其中相關(guān)耐藥位點進(jìn)行分析。

表1 巢式PCR引物

1.4 基因型分析由于HBV基因組重疊編碼，HBV S區(qū)（nt155～835）包含于RT區(qū)域內(nèi)[5]，根據(jù)RT區(qū)測序結(jié)果在線分析HBV基因型（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/genotyping/formpage.cgi）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料構(gòu)成比采用R×C表的x2檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 既往用藥情況在本組A181T/V和A181T/V+ N236T變異患者中，單用阿德福韋（adefovir，ADV）33例，拉米夫定（lamivudine，LAM）換用（或加用）ADV53例和替比夫定（telbivudine，LDT）換用ADV3例。比較后發(fā)現(xiàn)，ADV單藥治療組患者多發(fā)生A181T/V+N236T變異，而LAM換用（或加用）ADV治療組患者多發(fā)生A181T/V變異（表2）。

表2 不同藥物治療患者發(fā)生病毒基因變異〔（±s），%〕情況

表2 不同藥物治療患者發(fā)生病毒基因變異〔（±s），%〕情況

與A181T/V組比，P＜0.05

2.2 不同HBV變異患者感染病毒基因型分布在89例患者中，B基因型14例（15.7%），C基因型75例（84.3%），未見其他基因型。雖然C基因型中181T/V變異比例較高，但統(tǒng)計后未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P=0.322），表3。

表3 不同HBV變異患者感染病毒基因型分布（%）

2.3不同變異患者臨床特征比較在出現(xiàn)耐藥變異時，不同變異組患者年齡、性別比、ALT、AST、HBV DNA、HBsAg、HBeAg狀態(tài)等臨床指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（P＞0.05，表4）。

表4 A181T/V變異與A181T/V+N236T變異患者臨床特征比較（±s）

表4 A181T/V變異與A181T/V+N236T變異患者臨床特征比較（±s）

3 討論

HBV RT區(qū)包括7個功能亞區(qū)，分別是G、F、A、B、C、D、E亞區(qū)。A181位于B亞區(qū)，而N236位于D亞區(qū)。2000年臺灣學(xué)者最早在LAM耐藥患者中發(fā)現(xiàn)了rtA181變異的存在[6]，隨后在ADV和LDT上市前臨床研究中均發(fā)現(xiàn)可出現(xiàn)rtA181耐藥變異[7，8]。目前認(rèn)為rtA181變異對即將在國內(nèi)上市的替諾福韋（tenofovir，TDF）藥物敏感性也呈現(xiàn)一定程度的下降[9]。體外研究結(jié)果顯示，rtA181T/V變異株對LAM的敏感性較野生株降低了2～11倍，對ADV的敏感性下降2～7倍，對TDF的藥物敏感性僅下降1.2～3.2倍[1]；而rtN236T變異株對ADV的敏感性較野生株降低了7倍。但是，當(dāng)出現(xiàn)rtA181T/V+rtN236T聯(lián)合變異時，可對ADV的敏感性下降18倍以上，而對TDF的敏感性下降10倍以上[10]。共享耐藥模式（rtA181T/V）和雙重耐藥模式（rtA181T/V+rtN236T）使臨床后續(xù)抗病毒治療方案變得更加復(fù)雜和困難，并可增加發(fā)生終末期肝病的風(fēng)險[11]。因此，本研究對相關(guān)變異患者的臨床特征進(jìn)行了比較分析，以期為病情分析和抗病毒治療提供依據(jù)。

通過分析患者抗病毒用藥史后發(fā)現(xiàn)，rtA181V/T變異多發(fā)生于LAM換用（或加用）ADV治療的患者，而A181T/V+N236T多發(fā)生于ADV單藥治療的患者。國內(nèi)一項比較ADV初治耐藥與ADV挽救治療耐藥患者RT區(qū)特征的研究也有相同的結(jié)論[12]，他們發(fā)現(xiàn)在ADV初治耐藥患者中，rtA181V/T變異和rtA181V/ T+rtN236T變異的比例分別為36.99%和38.36%，而在ADV挽救治療耐藥患者中這兩種變異比例分別為61.76%和8.82%。這種變異模式在不同用藥史患者中的差異是否與NAs誘導(dǎo)的不同RT區(qū)空間構(gòu)象改變有關(guān)，尚有待進(jìn)一步驗證。

HBV基因型反應(yīng)病毒的異質(zhì)性，其分布存在地域差異。我國以B型和C型為主。既往有研究認(rèn)為在干擾素治療的患者中，其療效在A基因型優(yōu)于D基因型，B基因型優(yōu)于C基因型[13]。但這種治療結(jié)果的差異在NAs治療患者中未必存在。在我們研究的89例患者中，按照B、C基因型分組后發(fā)現(xiàn)，不同耐藥模式與基因型之間并沒有顯著性差異。另兩項研究也有相同的結(jié)論，即rtA181T/V變異分布與我國B、C基因型沒有關(guān)系[14，15]。這種基因型差異影響臨床表現(xiàn)主要由于干擾素和NAs不同抗病毒機(jī)理有關(guān)。干擾素主要通過激活免疫而清除病毒，NAs則直接抑制病毒復(fù)制。HBV基因型的差異可導(dǎo)致不同的病毒致病性和毒力有所不同。因此，通過免疫途徑起作用的干擾素治療可因基因型的差異產(chǎn)生不同的治療反應(yīng)和結(jié)局，而不通過免疫途徑的NAs抗病毒治療在不同基因型中則沒有顯著差異。

HBV發(fā)生耐藥變異時，患者的臨床表現(xiàn)往往輕重不一。導(dǎo)致這一現(xiàn)象是否與不同的病毒耐藥模式有關(guān)？一項來自302醫(yī)院的研究認(rèn)為，HBsAg水平在rtN236T單獨突變組與rtN236T+rtA181T聯(lián)合突變組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，但HBV DNA和ALT水平在rtN236T+rtA181T突變組中明顯高于rtN236T單獨突變組[16]。另一項來自上海瑞金醫(yī)院的研究，比較了6種不同變異模式下患者HBV DNA和ALT水平，結(jié)果均沒有統(tǒng)計學(xué)差異[17]。本研究發(fā)現(xiàn)不同變異患者年齡和性別分布、HBsAg定量、HBeAg狀態(tài)等方面，同樣沒有表現(xiàn)出差異。我們認(rèn)為：可能由于宿主體內(nèi)的病毒群是混合存在的，即使存在不同的變異，但由于體內(nèi)同時存在非變異毒株，最終臨床指標(biāo)反映了體內(nèi)準(zhǔn)種共同作用的表現(xiàn)。當(dāng)然，由于病例數(shù)的限制，具體結(jié)論尚需進(jìn)一步的大樣本研究。

由于HBsAg ORF內(nèi)的S基因區(qū)與RT區(qū)完全重疊，部分RT區(qū)變異可影響S區(qū)基因功能。體外實驗結(jié)果證明rtA181T變異后可引起HBsAg基因第172位編碼色氨酸（w）的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，即sW172stop變異，導(dǎo)致截短型的HBsAg[18]。動物實驗和臨床隨訪發(fā)現(xiàn)，這種截短型HBsAg具有潛在的致癌性[19～21]。在我們研究中，有1例耐藥變異患者后期發(fā)生了原發(fā)性肝癌，是否與rtA181T耐藥變異直接相關(guān)，亦有待進(jìn)一步研究。

通過本研究我們認(rèn)為：不同的NAs用藥史可導(dǎo)致A181T/V變異與A181T/V+N236T變異模式的差異；臨床上，rtA181T/V單獨變異和rtA181T/V+rtN236T聯(lián)合變異患者的臨床特征相近。由于這兩種變異的分子機(jī)制不同，具體“挽救”治療可能需要區(qū)別對待。

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（收稿：2013-05-06）

（校對：陳從新）

Clinical characteristics of patients with A181T/V mutation or A181T/V+N236T mutation in hepatitis B virus reverse transcriptase region after nucleoside treatment

Li Ping，Yang Zhiguo，Zhang Xin，et al.
Center for Liver Disease Research，81st Hospital of PLA，Nanjing 210002，China

ObjectiveTo compare the clinical features between patients infected with hepatitis B virus（HBV）presenting A181T/V mutation or A181T/V+N236T mutation in HBV reverse transcriptase region after nucleoside treatment.MethodsFifty-five patients with rtA181T/V mutation and 34 patients with rtA181T/V+rtN236T mutation were enrolled in this study.Their administration of nucleoside analogues was reviewed；Serum ALT，AST，HBV M and HBV DNA were detected；HBV genotypes were determined by DNA sequencing.ResultsIn adefovir treatment group，the A181T/V+N236T mutation was more common than rtA181T/V mutation（57.6%vs.42.4%，P＜0.05），while the occurrence of rtA181T/V mutation was higher than A181T/V+N236T mutation in patients receiving lamivudine treatment（75.5%vs.24.5%，P＜0.05）；In the total 89 patients in our series，there were 14 cases with genotypes B and 75 cases with genotype C of HBV infection，and there was no significant difference in the distribution of mutations between patients with either of the two genotype infection；There were no statistical differences as respect to age，gender，ALT，AST，HBV DNA，HBsAg titers and HBeAg status between the two groups of patients with different mutations.ConclusionsA given nucleoside analogue treatment leads to specific pattern of HBV reverse transcriptase region mutation；However，there is no special clinical significance between different mutations.

Hepatitis B；Nucleoside analogues；Reverse transcriptase region；Mutation

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.011

國家艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治專項（2008ZX10002-004）

210002南京市解放軍第81醫(yī)院肝病研究所

李平，男，33歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝病和傳染病的基礎(chǔ)和臨床工作。E-mail：leep2002@163.com