郝書理，張紀(jì)元，金 磊，孫 穎，李保森，馮國華，王福生，鄒正升

·酒精性肝病·

酒精性肝病患者血漿白細(xì)胞介素-21水平及重組IL-21對LX-2肝星狀細(xì)胞增殖和活化的影響*

郝書理，張紀(jì)元，金 磊，孫 穎，李保森，馮國華，王福生，鄒正升

目的分析酒精性肝病患者血漿白細(xì)胞介素-21（IL-21）水平及重組IL-21體外對LX-2肝星狀細(xì)胞增殖和活化的影響。方法采用ELISA法檢測17例酒精性肝炎、51例酒精性肝硬化患者和20例健康人血漿IL-21水平；體外培養(yǎng)LX-2肝星狀細(xì)胞，以IL-21（1ng/ml或10ng/ml）處理24 h或48 h，檢測LX-2細(xì)胞增殖及α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)。結(jié)果與健康對照人群比，酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者血漿IL-21水平均顯著升高（P＜0.05），但酒精性肝炎和肝硬化患者之間無顯著性差異，不同Child分級的肝硬化患者之間也無顯著性差異；在IL-21作用24～48 h后，LX-2細(xì)胞增殖水平與對照組比無顯著性差異，但α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)均較對照組顯著升高。結(jié)論血漿IL-21可能通過促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化參與了酒精性肝病患者肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

酒精性肝?。桓涡菭罴?xì)胞；白細(xì)胞介素-21；細(xì)胞活化

酒精性肝?。ˋlcoholic liver diseases，ALD）是西方發(fā)達(dá)國家的常見病，我國嗜酒人群的比例也在不斷升高。南方及中西部部分省份酒精性肝病流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，成人群體中ALD患病率為4.3%～6.5%。ALD占同期肝病住院患者的比例從1991年的4.2%增至1996年的21.3%。酒精性肝硬化在肝硬化病因中的構(gòu)成比從1999年的10.8%上升至2003年的24%[1]。白細(xì)胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）是2000年發(fā)現(xiàn)的“γ鏈家族”新成員，位于人類4號染色體，主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌，其中最主要的分泌細(xì)胞是Th17細(xì)胞及濾泡性輔助性T細(xì)胞（Tfh細(xì)胞）[2]。IL-21具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用[3，4]，主要包括對T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用、促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的增殖和功能促進(jìn)等。近年的研究提示，血漿IL-21與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，IL-21在HBV清除中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。在慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血漿IL-21水平上調(diào)，且與肝病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[6]。本實驗研究了ALD患者血漿IL-21水平變化，并初步探討了IL-21在體外對肝星狀細(xì)胞增殖和活化的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2013年4月～8月在我中心住院的酒精性肝炎患者17例，均為男性，酒精性肝硬化患者51例，均為男性，其中Child-Pugh A級21例，B級17例，C級13例。診斷依據(jù)“酒精性肝病診療指南”的標(biāo)準(zhǔn)[7]，排除HBV和HCV感染、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病和原發(fā)性肝癌。另選健康體檢者20例，均為男性。本研究在我院倫理委員會備案，每位受試者簽署知情同意書。研究人群的基線資料見表1。

表1 研究對象基線資料（±s）

表1 研究對象基線資料（±s）

①中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值；②Maddrey評分=4.6×[患者凝血酶原時間（s）—對照凝血酶原時間（s）]+血清膽紅素（mg/dl）。＞32為重度酒精性肝炎和應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療的參考閾值

1.2 實驗材料和試劑除了藻紅蛋白（PE）結(jié)合的抗人α-SMA（R&D，Minnesota，USA）以外，所有的抗體都購自BD Biosciences（San Jose，CA，USA）。重組人IL-21和檢測IL-21的ELISA試劑盒來自eBioscience公司（Santiago，USA）。細(xì)胞計數(shù)檢測試劑盒（Cell Counting Kit 8，CCK-8）購自日本同仁化學(xué)研究所，原理為WST-8[化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]的中間代謝產(chǎn)物為黃色甲瓚產(chǎn)物，該產(chǎn)物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，利用這一線性關(guān)系可以進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測。

1.3 LX-2細(xì)胞增殖的檢測將LX-2細(xì)胞【廣泛應(yīng)用的人肝星狀細(xì)胞（HSC）系，購自北京大學(xué)藥學(xué)部】[8]接種至24孔板，用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入青霉素（100U/m1）和鏈霉素（100μg/m1），在37℃、含5%C02孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到70%左右時，使用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。將LX-2細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞全部貼壁后，設(shè)不加（僅在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的空白組）或加IL-21（1 ng/ml或10 ng/ml），使其終體積為200μl，孵育24 h和48 h。加入CCK-8溶液20 μl，37℃孵育1 h，在酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值。

1.4 LX-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)的檢測將傳代的LX-2細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁，設(shè)不加（空白組）或加IL-21（1 ng/ml或10 ng/ml），孵育24 h和48 h，收集LX-2細(xì)胞于兩個流式管中，每管約五萬個細(xì)胞。將LX-2細(xì)胞用BD公司破膜劑破膜后，其中一管加入抗-α-SMA-PE 5 μl，另一管加入抗-IgG2a-PE 5μl，避光染色20 min，使用FACS Calibur和FlowJo軟件（TreeStar，Ashland，OR，USA）進(jìn)行檢測和分析；另分別在刺激后的24 h和48 h，向檢測孔中加入CCK-8溶液20 μl，37℃孵育1 h后，在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm處測定OD值。

1.5 血清IL-21檢測應(yīng)用ELISA法檢測。該ELISA試劑盒的最小檢測濃度為15 pg/ml。批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別＜5%和＜10%。所有樣品均進(jìn)行重復(fù)檢測。1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0版進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組之間使用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗進(jìn)行比較，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人群血漿IL-21水平比較ALD患者血漿IL-21水平較健康人明顯升高（P＜0.001），酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者血漿IL-21水平無明顯差異（P＞0.05），不同Child-Pugh分級酒精性肝硬化患者血漿IL-21水平也無顯著性差異（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組人群血漿IL-21水平比較

2.2 IL-21在體外對LX-2細(xì)胞的影響在1 ng/ml和10 ng/ml IL-21作用下，與空白組比，LX-2細(xì)胞增殖無明顯變化（P＞0.05）；在這兩種濃度的IL-21作用24 h和48 h后，LX-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)增強(qiáng)，說明IL-21可以明顯促進(jìn)LX-2細(xì)胞的活化（圖2）。

圖2 IL-21在體外對LX-2細(xì)胞的影響

3 討論

最近，有很多報道提示IL-21在感染性疾病中發(fā)揮重要的作用[8～9]，且在HBV感染的動物模型中也起到一定的作用[10～15]。

當(dāng)肝實質(zhì)細(xì)胞受到損傷時，鄰近的細(xì)胞通過旁分泌作用可分泌多種細(xì)胞因子作用于HSC，使之出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)竭_(dá)持續(xù)階段時，HSC則會出現(xiàn)活化、增殖、趨化細(xì)胞聚集、纖維形成、細(xì)胞收縮、基質(zhì)降解和維生素A消失等變化，進(jìn)而導(dǎo)致肝纖維化的形成。LX-2細(xì)胞作為肝星狀細(xì)胞的體外細(xì)胞系，可以表達(dá)α-SMA和波形蛋白[16～19]。因此，我們?yōu)樘接慖L-21對LX-2細(xì)胞的作用，設(shè)置空白組和不同濃度的IL-21刺激組。所設(shè)單純傳代培養(yǎng)細(xì)胞不添加任何細(xì)胞因子的刺激，可視為靜止期LX-2細(xì)胞，而加入了IL-21共培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞分泌α-SMA增加（P＜0.05），我們即認(rèn)為其已經(jīng)活化。目前HSC活化增殖的免疫學(xué)因素尚不完全清楚。近期研究表明IL-21參與了一系列的炎癥和促進(jìn)纖維化過程[20～23]，但是IL-21在ALD患者中的作用卻未見報道。因此，我們首先調(diào)查了IL-21在ALD患者血漿中的濃度，發(fā)現(xiàn)與健康人比較，ALD患者血漿IL-21水平明顯增高，提示IL-21可能在ALD發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。但是，它們在酒精性肝炎和酒精性肝硬化患者之間無統(tǒng)計學(xué)差異，造成這一結(jié)果的原因之一可能與本文兩組病例數(shù)之間存在差別（17例酒精性肝炎，51例酒精性肝硬化）。我們在體外實驗發(fā)現(xiàn)用IL-21刺激LX-2細(xì)胞，其增殖能力雖無明顯改變，但其活化程度顯著升高。這一結(jié)果提示IL-21在HSC的活化過程中發(fā)揮作用[24～25]，但作用的具體信號途徑還有待于進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，ALD患者血漿IL-21水平明顯升高，提示其可能在ALD發(fā)病中發(fā)揮著一定的作用，而IL-21可以促進(jìn)肝HSC的活化，提示增加的IL-21可能通過激活HSC，進(jìn)而加重肝臟的纖維化進(jìn)程。

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（收稿：2013-10-14）

（校對：陳從新）

Plasma IL-21 levels in patients with alcoholic liver diseases and the effects of recombinant IL-21 on proliferation and activation of LX-2 hepatic stellate cells in vitro

Hao Shuli，Zhang Jiyuan，Jin Lei，et al.
Center for Diagnosis and Treatment of Non-infectious Liver Disease，302nd Hospital，Beijing 100039，China

ObjectiveTo evaluate plasma IL-21 levels in patients with alcoholic liver diseases and the effects of recombinant IL-21 on proliferation and activation of LX-2 hepatic stellate cells in vitro.MethodsThe plasma levels of IL-21 in patients with alcoholic hepatitis（n=17），patients with alcoholic liver cirrhosis（n=51），and healthy controls（n=20）were measured by ELISA；the LX-2 hepatic stellate cells were subjected to recombinant IL-21 at the concentration of 1 ng/ml or 10 ng/ml for 24 or 48 hours，then the cell proliferation and expression of α-smooth muscle actin were determined by CCK-8 and by FACs，respectively.ResultsPlasma levels of IL-21 were significantly elevated in patients with alcoholic hepatitis and cirrhosis as compared to that in healthy controls（P＜0.05），however，no significant difference was observed between patients with alcoholic hepatitis and patients with alcoholic cirrhosis，and no significant difference was found among cirrhotic patients with different Child class either；Incubation of LX-2 hepatic stellate cells with IL-21 at 1 ng/ml or 10 ng/ml for 24 or 48 hours did not affect cellproliferation，but significantly increased the expression of α-smooth muscle actin in the cells（P＜0.05）. ConclusionIL-21 might contribute to the fibrogenesis in alcoholic liver diseases though induction of activation of hepatic stellate cells.

Alcoholic liver disease；LX-2 cells；Liver fibrosis；Hepatic stellate cells；Interleukin-21

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.006

國家自然科學(xué)基金面上項目（81273249）

100039北京市北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部教學(xué)醫(yī)院解放軍第302醫(yī)院非感染性肝病診療中心（郝書理，孫穎，李保森，鄒正升）；肝病生物治療研究中心（張紀(jì)元，金磊，馮國華，王福生）

郝書理，女，24歲，碩士研究生。E-mail：haoshuli302@163. com

鄒正升，E-mail：zszou302@163.com