劉靜, 王亞楠, 孫亞奇, 王洪洋, 汪超, 彭中鎮(zhèn), 劉榜

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070

豬13號(hào)染色體上拷貝數(shù)變異區(qū)內(nèi)基因信息發(fā)掘及遺傳規(guī)律分析

劉靜, 王亞楠, 孫亞奇, 王洪洋, 汪超, 彭中鎮(zhèn), 劉榜

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070

拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是染色體上發(fā)生的一種微結(jié)構(gòu)變異, 已引起越來(lái)越多研究者的關(guān)注。本課題組前期已獲得豬13號(hào)染色體上的32個(gè)CNV區(qū)域(CNV region, CNVR), 為了發(fā)掘CNVR內(nèi)的基因信息, 文章在線檢索了上述CNVR內(nèi)的基因并進(jìn)行基因本體(Gene Ontology)分析。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)236個(gè)基因, 其中有注釋基因169個(gè), 主要參與蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞粘附、大分子降解等生物過(guò)程。為了探索這些基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律, 文章選擇RCAN1(Regulators of calcineurin 1)基因?yàn)楹蜻x基因, 利用QPCR方法在萊蕪豬群中檢測(cè)了該基因的拷貝數(shù), 并分析了CNV在萊蕪豬3個(gè)家系中的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明, RCAN1基因在萊蕪豬群體中存在拷貝數(shù)的缺失、重復(fù)現(xiàn)象, 其拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律符合孟德?tīng)栠z傳方式。

拷貝數(shù)變異; 13號(hào)染色體; RCAN1基因; 遺傳規(guī)律; 萊蕪豬

拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)是指與生物正常的基因組序列(或參考基因組序列)相比,基因組中所發(fā)生的長(zhǎng)度在1 kb至數(shù)Mb之間的變異,其形式包括重復(fù)、缺失、插入、易位及衍生出的染色體結(jié)構(gòu)變異[1]。由于CNV長(zhǎng)度跨度較大, 以致它可以包含一個(gè)基因或基因的一部分, 也可以跨越多個(gè)基因, 在基因組中覆蓋的核苷酸總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)總數(shù)。研究發(fā)現(xiàn), CNV可以通過(guò)劑量效應(yīng)改變基因的表達(dá)量[2], 也可以影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而影響基因的表達(dá)[3,4], 它對(duì)表型變異的潛在影響可能要比SNP的影響更大。本課題組余少波等[5]利用豬60K SNP芯片技術(shù)在中外9個(gè)豬品種和1個(gè)雜種群體(杜洛克豬×通城豬)中發(fā)現(xiàn)了大量拷貝數(shù)變異區(qū)域(Copy number variation region, CNVR), 繪制了中外豬品種的全基因組CNV圖譜, 發(fā)現(xiàn)豬13號(hào)染色體(Sus scrofa chromosome 13, SSC13)上存在32個(gè)CNVR。其中萊蕪豬尤其特殊, 在13號(hào)染色體上存在大范圍的染色體缺失或重復(fù)區(qū)域, 但是未對(duì)SSC13上32個(gè)CNVR存在的真實(shí)性、它們的分類與長(zhǎng)度分布、具有Ensembl ID基因與注釋基因的個(gè)數(shù)及拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律進(jìn)行探究。

本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上, 分析計(jì)算SSC13上CNVR的分類及長(zhǎng)度分布; 利用生物信息學(xué)方法檢索SSC13上32個(gè)CNVR內(nèi)的基因并分析其功能; 選擇鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)因子1(Regulators of calcineurin 1, RCAN1)基因?yàn)楹蜻x基因, 利用QPCR方法在 38頭萊蕪豬中檢測(cè)該基因的拷貝數(shù),并在該品種3個(gè)家系共15個(gè)個(gè)體中對(duì)該基因拷貝數(shù)變異進(jìn)行遺傳規(guī)律分析。

1 材料和方法

1.1 材料

檢測(cè)RCAN1基因拷貝數(shù)所用DNA樣品來(lái)自山東省萊蕪市萊蕪豬原種場(chǎng)38頭萊蕪豬的耳組織, 并用杜洛克豬作為參考基因組。

萊蕪豬的A、B、C 3個(gè)家系用于分析RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律。A、B家系均包含父本、母本及3個(gè)子代個(gè)體, C家系包含父本、母本及4個(gè)子代個(gè)體。B、C為同父異母的半同胞家系。

1.2 豬13號(hào)染色體上CNVR內(nèi)基因的發(fā)掘與其功能預(yù)測(cè)方法

利用 Ensembl中的 BioMart工具(http://asia. ensembl.org/biomart/martview/)檢索SSC13上CNVR內(nèi)的基因信息。應(yīng)用基因本體(Gene Ontology, GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)將豬 CNVR內(nèi)的基因與人的基因進(jìn)行同源比對(duì), 根據(jù)同源基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能、所參與的生物學(xué)過(guò)程等信息, 預(yù)測(cè)SSC13上CNVR中的基因功能。

1.3 利用 QPCR方法檢測(cè)萊蕪豬 13號(hào)染色體上RCAN1基因的拷貝數(shù)

通過(guò)檢索SSC13上CNVR內(nèi)的基因, 發(fā)現(xiàn)RCAN1基因位于 CNVR內(nèi), 并且其功能與免疫相關(guān), 但是豬中尚無(wú)該基因的研究報(bào)道, 本研究利用 QPCR方法在38頭萊蕪豬群體中檢測(cè)RCAN1基因的拷貝數(shù)。

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia.ensembl.org/index. html)中獲取RCAN1基因(ENSSSCG00000012050)的全長(zhǎng)序列, 用Primer5.0設(shè)計(jì)4對(duì)引物, 引物位于該基因的上游和下游(表1)。10 μL反應(yīng)體系包括：1 μL DNA模板, 上下游引物各0.2 μL, Taq DNA聚合酶(Biotium公司)0.1 μL, dNTP混合物0.3 μL, PCR緩沖液1 μL, 加雙蒸水至10 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 15 s, 34個(gè)循環(huán); 最后再72℃延伸5 min。取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物, 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收目的片段, 通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證引物的擴(kuò)增準(zhǔn)確性。

表1 RCAN1基因PCR擴(kuò)增引物信息

1.3.2 QPCR擴(kuò)增

QPCR采用SYBR Green相對(duì)定量的方法, 以萊蕪豬基因組 DNA為模板, 以胰高血糖素(Glucagon, GCG)基因?yàn)閮?nèi)參基因[6], 用RCAN1S1A1擴(kuò)增RCAN1基因, 每個(gè)個(gè)體 3次重復(fù)。反應(yīng)體系按照 Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 反應(yīng)體積為10 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 60℃30 s, 72℃ 15 s, 34個(gè)循環(huán); 最后再72℃延伸5 min。

1.3.3 RCAN1基因拷貝數(shù)的估計(jì)

以 2-ΔΔCt為基礎(chǔ), 利用公式：拷貝數(shù)=21-ΔΔCt對(duì)QPCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算, 采用四舍五入方法對(duì)基因拷貝數(shù)進(jìn)行估計(jì)。正常個(gè)體中, RCAN1基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因相同, 即 2個(gè)拷貝; 具有 CNV的個(gè)體中,該基因拷貝數(shù)會(huì)發(fā)生增加或缺失。

1.4 RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析

以CNVR內(nèi)的RCAN1基因?yàn)楹蜻x基因, 以3個(gè)萊蕪豬家系為材料, 利用 QPCR方法檢測(cè)該基因拷貝數(shù), 分析每條染色體上可能含有的拷貝數(shù)情況,判斷RCAN1基因的拷貝數(shù)變異在3個(gè)萊蕪豬家系中是否符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬13號(hào)染色體上CNVR的分類與長(zhǎng)度分布

本課題組前期研究獲得了 SSC13上的 32個(gè)CNVR, 其中16個(gè)是重復(fù)區(qū)域, 10個(gè)為缺失區(qū)域, 6個(gè)同時(shí)存在重復(fù)和缺失的區(qū)域[5]。本研究計(jì)算結(jié)果表明：所有CNVR全長(zhǎng)45 722 kb, 占該染色體總長(zhǎng)的20.9%,平均每個(gè)CNVR長(zhǎng)1428 kb, 最大的可達(dá)12 411 kb,最小的僅27.6 kb, CNVR的中值為250.1 kb。

2.2 豬13號(hào)染色體CNVR中的基因注釋及其功能分析

使用Ensembl中的Biomart工具檢索本課題組前期獲得的SSC13上32個(gè)CNVR內(nèi)的基因, 發(fā)現(xiàn)具有Ensembl ID的基因共236個(gè), 其中注釋基因169個(gè)(占71.6%)。CNVR中, 基因的密度為5.16/Mb。

將上述 236個(gè)基因與人類基因進(jìn)行同源比對(duì),發(fā)現(xiàn)其中的 180個(gè)基因在人基因組中進(jìn)行過(guò)注釋。GO分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與蛋白質(zhì)水解(Proteolysis)、細(xì)胞粘附(Cell adhesion)、大分子降解(Macromolecule catabolic process)等生物學(xué)過(guò)程, 并具有調(diào)節(jié)酶活性(Peptidase activity)、離子通道活性(Ion channel activity)的生物學(xué)作用(圖1)。

2.3 豬13號(hào)染色體上RCAN1基因的拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析, 參考基因組上無(wú)其他與RCAN1基因高度同源序列, 因此推斷該基因在每條染色體上各含有 1個(gè)拷貝。QPCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示：該基因在10個(gè)個(gè)體中發(fā)生了拷貝數(shù)的增加, 在14個(gè)個(gè)體中發(fā)生了拷貝數(shù)的缺失(圖 2), 說(shuō)明在不同萊蕪豬個(gè)體中, RCAN1基因存在拷貝數(shù)變異, 與SNP芯片檢測(cè)結(jié)果一致, 從而進(jìn)一步驗(yàn)證了CNVR內(nèi)拷貝數(shù)變異的真實(shí)存在。

2.4 候選基因 RCAN1拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果

分析樣本來(lái)自萊蕪豬A、B、C 3個(gè)家系15個(gè)個(gè)體。利用QPCR方法所檢測(cè)的3個(gè)家系親子兩代的 RCAN1基因的拷貝數(shù)及其拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果如圖3所示。

從圖3可看出：①A家系中父本含有1個(gè)拷貝,基因型為0/1, 母本含有3個(gè)拷貝, 基因型為 1/2, 3個(gè)子代個(gè)體分別有 1、3、2個(gè)拷貝, 基因型分別為0/1、1/2、1/1或 0/2; ②B、C家系為同一父本, 父本均有2個(gè)拷貝, 基因型均為0/2, 母本均有1個(gè)拷貝, 基因型均為0/1, 所有子代個(gè)體包含1、2、3 共3種拷貝數(shù)和0/1、0/2、1/2共3種基因型。③在同一個(gè)體的一條染色體上 RCAN1基因的拷貝數(shù)不同,有缺失(0個(gè)拷貝)也有重復(fù)(2個(gè)拷貝), 但是萊蕪豬個(gè)體中不存在缺失純合子(0/0)。

圖1 GO方法預(yù)測(cè)豬13號(hào)染色體上CNVR內(nèi)基因功能的結(jié)果1：蛋白質(zhì)水解; 2：細(xì)胞粘附; 3：生物粘附; 4：大分子降解; :5：離子轉(zhuǎn)運(yùn); 6：細(xì)胞外蛋白質(zhì)代謝; 7：細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝; 8：蛋白質(zhì)分解; 9：陽(yáng)離子運(yùn)輸; 10：修飾依賴的大分子代謝; 11：修飾依賴的蛋白質(zhì)代謝; 12：細(xì)胞間粘附; 13：不依賴鈣的細(xì)胞間粘附; 14：肽酶活性; 15：作用于亮氨酸的肽酶活性; 16：細(xì)胞內(nèi)肽酶活性; 17：離子通道活性; 18：底物特異性通道活性; 19：通道活性; 20：堿金屬離子結(jié)合; 21：門(mén)控通道活性; 22：清道夫受體活性。

圖2 QPCR方法檢測(cè)萊蕪豬13號(hào)染色體上RCAN1基因拷貝數(shù)的結(jié)果相對(duì)于參考個(gè)體D4509, 有10個(gè)個(gè)體(604、993、1163、48、1268、2424、934、340、1647和1631)發(fā)生了拷貝數(shù)的增加, 有14個(gè)個(gè)體(3022、1721、307、1661、1653、1602、1680、1604、1596、209、163、1592、2715和538)發(fā)生了拷貝數(shù)的缺失。

3 討 論

3.1 豬13號(hào)染色體具有豐富的CNV及其在標(biāo)記選擇中的可能作用

根據(jù)Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)提供的信息, 豬13號(hào)染色體全長(zhǎng)約218 635 kb, 所有CNVR長(zhǎng)度45 721 kb, 約占13號(hào)染色體的20.9%。Li等[7]發(fā)現(xiàn)在豬的不同染色體中, CNVR所占的比例介于 0.14%～1.87%之間; 在綿羊的不同染色體上, CNV可以覆蓋0.46%～5.08%[8]; 牛的不同染色體中, CNVR約占 0.08%～3.5%[9]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), SSC13上CNVR的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在豬、綿羊、牛中已有的報(bào)道。另外, 本研究中豬 13號(hào)染色體上CNVR重復(fù)區(qū)域數(shù)(16個(gè))要多于缺失區(qū)域數(shù)(10個(gè)),這與已有的報(bào)道中各染色體上缺失區(qū)域數(shù)多于重復(fù)區(qū)域數(shù)[10]的結(jié)果不一致。這說(shuō)明本研究中SSC13上具有豐富的拷貝數(shù)變異。

圖3 RCAN1基因拷貝數(shù)變異的遺傳規(guī)律分析結(jié)果

Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中, 豬13號(hào)染色體全長(zhǎng)含編碼基因1298個(gè), 計(jì)算得出基因密度為5.95/Mb。Conrad等[11]和 Freeman等[12]在人類基因組的研究結(jié)果表明：CNV更多的趨向于發(fā)生在基因匱乏的區(qū)域。而本研究發(fā)現(xiàn)SSC13上CNVR內(nèi)的基因密度與該染色體上的基因密度差異不顯著, 這說(shuō)明豬的13號(hào)染色體上CNV的分布比較均勻, 并不趨向于發(fā)生在基因匱乏或者基因富集的區(qū)域。

根據(jù)比較基因組學(xué)方法所得出的結(jié)果推斷, SSC13上CNVR中的180個(gè)基因其生物學(xué)功能可能涉及參與蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞粘附過(guò)程, 可能影響機(jī)體能量代謝和免疫等生物學(xué)活動(dòng)。課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)萊蕪豬尤其特殊, 在13號(hào)染色體上存在大范圍的染色體缺失或重復(fù)區(qū)域, 而萊蕪豬具有肌內(nèi)脂肪含量高的種質(zhì)特性[13], 是目前所報(bào)道的肌內(nèi)脂肪含量最高的品種。CNV的存在是否與萊蕪豬的高肌內(nèi)脂肪含量有關(guān), CNVR內(nèi)的基因是否可作為萊蕪豬的候選基因值得進(jìn)一步研究。

3.2 關(guān)于QPCR驗(yàn)證結(jié)果及遺傳規(guī)律分析

根據(jù)RCAN1基因在3個(gè)萊蕪豬家系上下代中的拷貝數(shù), 假設(shè)該基因存在 2個(gè)及以上拷貝時(shí), 呈現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)且完全連鎖, A家系中, 父本的基因型為0/1, 母本的基因型可能存在0/3或1/2兩種情況, 如果母本為0/3, 后代會(huì)有0/0、0/1、0/3、1/3等4種基因型和0、1、3、4共4種拷貝數(shù); 如果為1/2, 后代會(huì)有0/1、0/2、1/1、1/2這4種基因型和1、2、3等3種拷貝數(shù), 由于子代中出現(xiàn)了RCAN1基因拷貝數(shù)為2的個(gè)體, 所以母本的基因型只能是1/2。B、C家系中, 母本基因型均為 0/1, 父本基因型可能存在1/1或0/2兩種情況, 如果為1/1, 后代會(huì)有0/1、1/1兩種基因型和1、2兩種拷貝數(shù); 如果為0/2, 后代會(huì)有0/0、0/1、0/2、1/2這4種基因型和0、1、2、3共4種拷貝數(shù), 由于C家系子代中出現(xiàn)了RCAN1基因拷貝數(shù)為 3的個(gè)體, 那么父本的基因型只能為0/2。由此推斷該基因的拷貝數(shù)變異在萊蕪豬群體中符合孟德?tīng)柗蛛x定律, 為CNV的遺傳規(guī)律研究提供了素材和研究基礎(chǔ)。

B、C家系中, 父本基因型為0/2, 母本基因型為0/1, 則可以產(chǎn)生0/0、0/1、0/2、1/2共4種基因型的后代, 但是本研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因型為 0/0的子代個(gè)體, 可能是因?yàn)楸狙芯康募蚁岛啃? 不能使所有的基因型在后代都能出現(xiàn)。另一方面, RCAN1基因可以調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin, CN)的活性, Park等[14]的研究表明RCAN1基因的表達(dá)與唐氏綜合征具有密切關(guān)系, Ermak等[15]也發(fā)現(xiàn)RCAN1基因在人腦中的高表達(dá)可以引起阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease, AD), 說(shuō)明RCAN1基因在一些疾病中發(fā)揮了重要作用。本研究在萊蕪豬3個(gè)家系中未發(fā)現(xiàn)缺失純合體, 這可能是因?yàn)镽CAN1基因具有重要功能, 缺失純合體生活力弱或者胚胎期已死亡。這種推斷尚有待進(jìn)一步在群體中進(jìn)行驗(yàn)證或在細(xì)胞水平上進(jìn)行研究。

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(責(zé)任編委: 李紹武)

Investigation of genes within copy number variation regions in pig chromosome 13 and analysis of the genetic law

Jing Liu, Yanan Wang, Yaqi Sun, Hongyang Wang, Chao Wang, Zhongzhen Peng, Bang Liu

Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Copy number variation (CNV), referring to a genome structure variation, has attracted researchers’ great interests. Thirty-two CNV regions (CNV region, CNVR) have been detected on chromosome 13 in our previous work. In order to detect the genes located in these CNVRs, we first obtained the annotated information from Ensembl database, and searched gene functional enrichments using DAVID online tools. In the 32 CNVRs, a total of 236 genes were identified, in which 169 genes were annotated. Gene Ontology (GO) analysis revealed that these genes mainly participate in proteolysis, cell adhesion, and macromolecular catabolic process. To study the genetic law of these CNVs, we chose the RCAN1 (regulators of calcineurin 1) gene as the candidate. We quantified the copy number of RCAN1 gene in 38 Laiwu pigs by usingQPCR method, and analyzed the genetic laws in three Laiwu families including 15 pigs. QPCR results showed that both duplication and deletion occurred in RCAN1 gene among Laiwu pigs and the heredity mode corresponds with Mendelian genetic law.

copy number variation; chromosome 13; RCAN1 gene; genetic law; Laiwu pigs

2013-10-14;

2013-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31072012)和全國(guó)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(編號(hào)：201210504001)資助

劉靜, 碩士研究生, 專業(yè)方向：動(dòng)物功能基因組學(xué)。E-mail: liujing7791621@163.com

劉榜, 博士, 教授, 研究方向：動(dòng)物分子生物學(xué)與育種。E-mail: liubang@mail.hzau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0354

時(shí)間: 2014-2-13 14:24:20

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140213.1424.001.html