項(xiàng)崢，陳獻(xiàn)忠，張利華，沈微，樊游，陸茂林

1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；

2. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，無錫 214063

利用可重復(fù)使用的URA3標(biāo)記基因建立熱帶假絲酵母基因敲除系統(tǒng)

項(xiàng)崢1，陳獻(xiàn)忠1，張利華1，沈微1，樊游1，陸茂林2

1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；

2. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，無錫 214063

熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)在發(fā)酵工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力，但二倍體遺傳結(jié)構(gòu)和較低的遺傳轉(zhuǎn)化效率限制了其代謝工程育種技術(shù)的應(yīng)用。建立可靠的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)并高效的刪除目的基因是代謝工程改造熱帶假絲酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336為出發(fā)菌株，通過化學(xué)誘變篩選獲得了尿嘧啶缺陷型突變株C. tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase，PDC)基因作為靶基因構(gòu)建了兩端包含同源臂并在選擇性標(biāo)記C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase，乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶)基因兩側(cè)同向插入源于沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisGPDC1(PHUHP)，并轉(zhuǎn)化宿主菌株C. tropicalis XZX，篩選獲得PHUHP片段正確整合到染色體的PDC基因位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子XZX02。在此基礎(chǔ)上，將轉(zhuǎn)化子 XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)選擇培養(yǎng)基上，篩選得到URA3基因從PHUHP片段中丟失的營養(yǎng)缺陷型菌株XZX03。進(jìn)一步構(gòu)建了第2個(gè)PDC等位基因的刪除表達(dá)盒PDCm-URA3-PDCm，并轉(zhuǎn)化C. tropicalis XZX03菌株，獲得轉(zhuǎn)化子C. tropicalis XZX04。經(jīng)PCR和DNA測序確認(rèn)轉(zhuǎn)化子C. tropicalis XZX04細(xì)胞染色體上的兩個(gè)PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一種營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可重復(fù)使用的熱帶假絲酵母遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，利用該技術(shù)成功敲除了細(xì)胞的 PDC基因，為進(jìn)一步利用代謝工程改造熱帶假絲酵母奠定了基礎(chǔ)。

熱帶假絲酵母；遺傳轉(zhuǎn)化；同源重組；URA3基因；基因敲除

熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)是一種二倍體酵母，在發(fā)酵工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。作為一種重要的工業(yè)微生物，熱帶假絲酵母胞內(nèi)高效的 β-氧化途徑賦予其能夠利用烷烴和脂肪酸作為唯一碳源，合成長鏈二元酸。目前，利用熱帶假絲酵母發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[1]。熱帶假絲酵母也能轉(zhuǎn)化木糖生產(chǎn)木糖醇。木糖醇在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法生產(chǎn)木糖醇工藝復(fù)雜且成本較高，而微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)木糖醇具有條件溫和、操作簡便、副產(chǎn)物少、環(huán)境污染低等優(yōu)點(diǎn)[2]。已知有多種假絲酵母均可以生產(chǎn)木糖醇，而熱帶假絲酵母是其中最佳的木糖醇生產(chǎn)菌，其利用木質(zhì)纖維素水解物發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇具有廣闊的前景[3]。另一方面，熱帶假絲酵母也能利用有機(jī)廢水生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白[4,5]。該工藝不僅使有機(jī)廢水循環(huán)利用，有益于環(huán)境保護(hù)，又能變廢為寶，獲得有價(jià)值的生物產(chǎn)品。目前熱帶假絲酵母已成功用于馬鈴薯淀粉廢水[6]、紅麻亞銨法制漿廢液[7]、木薯淀粉酒精廢液[8]、苧麻生物脫膠廢水[9]等有機(jī)廢水的生物處理以及用于分離脫臭餾出物中植物甾醇的研究[10]。在醫(yī)學(xué)上，熱帶假絲酵母作為一種條件致病菌，其毒力與致病性對免疫功能不全患者的威脅僅次于白色念珠菌(Candida albicans)[11]，歐洲將熱帶假絲酵母歸類進(jìn)致病微生物中，用于生產(chǎn)和研究需要相當(dāng)高的安全標(biāo)準(zhǔn)[12]。

由于熱帶假絲酵母在工業(yè)生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究價(jià)值，利用代謝工程進(jìn)行菌株改良受到了廣泛關(guān)注。高效的遺傳轉(zhuǎn)化和基因刪除技術(shù)是代謝工程育種的前提。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在熱帶假絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化和基因刪除技術(shù)上開展了多方面的研究。Hara等[13]以潮霉素B抗性作為篩選標(biāo)記，構(gòu)建了熱帶假絲酵母URA3基因敲除突變盒，并對其等位基因的兩個(gè)拷貝分別進(jìn)行了破壞；他們還將該方法成功應(yīng)用于敲除單個(gè)拷貝的POX4基因。高弘等[14]則分別利用潮霉素B抗性和G418抗性作為選擇性標(biāo)記構(gòu)建了兩個(gè)不同的基因敲除表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化熱帶假絲酵母，獲得了兩個(gè)拷貝的肉毒堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Carnitine acetyltransferase, CAT)基因同時(shí)缺失的熱帶假絲酵母突變株。盡管如此，利用抗生素抗性作為篩選標(biāo)記依仍然存在不少問題。首先，由于菌種、菌株的不同，其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、生理生化特性和遺傳背景相差較大，抗性標(biāo)記難以成為一種通用的篩選標(biāo)記，在實(shí)際使用上有很大的限制[15]。其次，熱帶假絲酵母在密碼子使用方面具有特殊性，常將CUG密碼子(通常被翻譯成亮氨酸)翻譯成絲氨酸的特性[16]，這就限制了外源性抗性基因作為選擇性標(biāo)記使用的效率。另外，在二倍體酵母的基因敲除中，往往需要多個(gè)抗性基因作為選擇性標(biāo)記來完成多拷貝靶基因的敲除，進(jìn)一步限制了抗性標(biāo)記的使用。

目前，熱帶假絲酵母的遺傳轉(zhuǎn)化主要利用尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型作為選擇性標(biāo)記，并以此為基礎(chǔ)完成了多個(gè)靶基因的敲除。Haas等[17]最早建立起以營養(yǎng)缺陷型菌株為基礎(chǔ)的熱帶假絲酵母DNA整合系統(tǒng)。利用這套轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，Picataggio等[18]通過對POX4和POX5基因進(jìn)行連續(xù)破壞，建立了在同一株熱帶假絲酵母細(xì)胞進(jìn)行多基因連續(xù)敲除技術(shù)。然而該基因連續(xù)敲除系統(tǒng)中，每完成一次基因的單拷貝敲除，就需要通過突變或者分子手段使轉(zhuǎn)化子重新回復(fù)成尿嘧啶缺陷型，操作十分繁瑣。Alani等[19]在釀酒酵母中建立了一種利用在 URA3基因兩段分別插入一段源于沙門氏菌(Salmonella)的hisG重復(fù)序列的方法，可快速重復(fù)利用選擇標(biāo)記。Ko等[20]將該方法應(yīng)用于熱帶假絲酵母的基因敲除實(shí)驗(yàn)并獲得了 XYL2基因單拷貝敲除的雜合子突變株和雙拷貝敲除的純合子突變株。

本文建立了基于尿嘧啶缺陷型標(biāo)記基因重復(fù)利用的熱帶假絲酵母基因連續(xù)敲除方法，并成功敲除了二倍體細(xì)胞中的PDC基因。

1 材料和方法

1.1 菌種、質(zhì)粒

熱帶假絲酵母ATCC20336和大腸桿菌(Escherichia coli)JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pCUB6由中科院上海生物化學(xué)研究所陳江野研究員饋贈(zèng)。

1.2 尿嘧啶缺陷型突變株的篩選

[21]，通過1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(NTG)化學(xué)誘變法獲得尿嘧啶缺陷型突變株。原始菌株C. tropicalis ATCC 20336在YPD培養(yǎng)基(酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%)中30℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)，細(xì)胞生物量OD600到1.0時(shí)，離心收集細(xì)胞并無菌去離子水洗滌一次。將細(xì)胞重懸在 10 mL YPD培養(yǎng)基中，傾入含1～4 mg NTG的無菌50 mL離心管中，37℃、200 r/min培養(yǎng)40 min。離心收集菌體，并用無菌去離子水洗滌2次后于YPD培養(yǎng)基中后培養(yǎng)3 h，然后用MM培養(yǎng)基(YNB 0.67%、硫酸銨1%、葡萄糖2%)洗滌2次，再轉(zhuǎn)入MM培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)6～8 h，加入制霉菌素使其終濃度達(dá)50 μg/mL。培養(yǎng) 2 h后，離心收集菌體，并用無菌去離子水洗滌2次，轉(zhuǎn)入YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，取適量涂布FOA培養(yǎng)基(SM + 5-氟乳清酸0.1%)平板，30℃培養(yǎng)2 d。將長出的單菌落分別點(diǎn)種于MM和SM培養(yǎng)基(MM + 尿嘧啶0.006%)平板上，在MM培養(yǎng)基平板不長而在 SM培養(yǎng)基平板生長的菌株即初步確認(rèn)為突變株，待進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3 PDC基因敲除突變盒的構(gòu)建

根據(jù) NCBI中熱帶假絲酵母的 URA3基因(GenBank登錄號(hào)：AB006207)設(shè)計(jì)上下游引物URA3-F和URA3-R(表1)，以熱帶假絲酵母ATCC 20336菌株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得1.6 kb的URA3基因片段，插入pMD18-T載體中，獲得重組質(zhì)粒，命名為T-URA3。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化質(zhì)粒，回收URA3片段備用。根據(jù)NCBI中熱帶假絲酵母MYA-3404菌株的 PDC 基因(NCBI Reference Sequence: XM_002549483.1)設(shè)計(jì)引物 PDC-F1和PDC-R1(表1)，以熱帶假絲酵母ATCC 20336菌株的基因組為模板，PCR獲得1.7 kb的PDC基因片段，插入pMD18-T simple載體中，獲得重組質(zhì)粒，命名為Ts-PDC。然后以Ts-PDC為模板，PDCrFE和PDCrRP為引物，反向 PCR獲得含有兩段同源臂的PDC1-Ts-PDC1片段。用EcoRⅠ和PstⅠ消化后，與回收的URA3片段連接，獲得重組質(zhì)粒Ts-PDC1-URA3。

表1 PCR引物序列

根據(jù)文獻(xiàn)[20]設(shè)計(jì)引物 HisG-F1和 HisG-R1、HisG-F2和HisG-R2兩對引物(表1)，以質(zhì)粒pCUB6為模板，PCR獲得大小均為1.1 kb的hisG1片段和hisG2片段，將hisG1插入Ts-PDC1-URA3上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒。后將hisG2片段插入該重組質(zhì)粒上的 SalⅠ和 PstⅠ酶切位點(diǎn)之間，獲得帶有 PDC1-hisG1-URA3-hisG2-PDC1片段(PHUHP片段)的重組質(zhì)粒，命名為 Ts-PHUHP，重組質(zhì)粒物理圖譜如圖1A所示。

根據(jù)擴(kuò)增獲得的 PDC基因的測序結(jié)果設(shè)計(jì)引物PDC-F2和PDC-R2，以熱帶假絲酵母ATCC 20336菌株的基因組為模板，PCR獲得600 bp的PDCm片段。PDCm片段是PDC基因片段的中間部分，位于上述第一個(gè)敲除突變盒中用到的兩段PDC同源臂片段之間。依上述方法，構(gòu)建 Ts-PDCm-URA3，重組質(zhì)粒物理圖譜如圖1B所示。本文所用的引物(表1)合成及測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。分子克隆所用的工具酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 酵母的轉(zhuǎn)化

氯化鋰(LiCl)轉(zhuǎn)化法參考文獻(xiàn)[17]。將宿主菌培養(yǎng)至OD600為1.0左右，離心收集細(xì)胞，用TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4、1 mmol/L EDTA)清洗一次，重懸在1 mL 100 mmol/L氯化鋰中，30℃、200 r/min孵育1 h。取88 μL細(xì)胞，與10 μL DNA片段和2 μL鮭魚精混勻，30℃孵育30 min。

再加入900 μL PEG3350溶液(40% PEG3350、100 mmol/L 氯化鋰)，30℃、200 r/min孵育1 h。然后42℃熱激5 min，快速冷卻至室溫，離心收集細(xì)胞，無菌水清洗1次，涂布MM平板，30℃培養(yǎng)2～3 d。

醋酸鋰(LiAc)轉(zhuǎn)化法參考文獻(xiàn)[20]。將宿主菌培養(yǎng)至OD600為1.0左右，離心收集細(xì)胞，用無菌去離子水清洗，重懸在1 mL醋酸鋰溶液(0.1 mol/L醋酸鋰、10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6、1 mmol/L EDTA)中，取30 μL細(xì)胞，與50 μL DNA片段、5 μL鮭魚精以及400 μL PEG8000溶液(50%的PEG8000溶于醋酸鋰溶液中)混勻，30℃孵育30 min，42℃熱激15 min，快速冷卻至室溫，離心收集細(xì)胞，用無菌去離子水清洗1次，涂布MM平板，30℃培養(yǎng)2～3 d。

1.5 PDC基因敲除與URA3基因的重復(fù)利用

熱帶假絲酵母細(xì)胞兩個(gè) PDC基因拷貝的敲除流程如圖2所示。將轉(zhuǎn)入PHUHP基因刪除表達(dá)盒并成功整合于染色體上的熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化子菌株接種于SM培養(yǎng)基中于30℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)，細(xì)胞生物量OD600達(dá)到1.0時(shí)，離心收集細(xì)胞，用無菌去離子水重懸后，涂布于2×FOA培養(yǎng)基(SM + 5-氟乳清酸0.2%)平板，于30℃培養(yǎng)2～3 d，將長出的單菌落轉(zhuǎn)接于SM平板培養(yǎng)，提取染色體并PCR驗(yàn)證，將獲得的 URA3標(biāo)記基因剔除的突變株保藏并應(yīng)用于第二輪轉(zhuǎn)化。

1.6 PDC酶活測定

參考文獻(xiàn)[22]制備細(xì)胞抽提物。酵母細(xì)胞接種于50 mL YPD或者SM液體培養(yǎng)基，于30℃、200 r/min培養(yǎng)16 h后，離心收集細(xì)胞。用10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(含2 mmol/L EDTA，pH7.5)洗2次，離心后用 3 mL 100 mmol/L磷酸鈉緩沖液(含 2 mmol/L MgCl2，pH7.5)重懸。按工作2 s間歇冷卻4 s的方式，超聲破碎菌體，每15 min取樣鏡檢觀察細(xì)胞破碎情況。待觀察到細(xì)胞破碎基本完全，12 000 r/min離心5 min，上清液即細(xì)胞抽提物。該上清液用于后續(xù)測定蛋白含量以及丙酮酸脫羧酶活性。

圖1 重組質(zhì)粒Ts-PHUHP和Ts-PDCm-URA3的物理圖譜A：重組質(zhì)粒Ts-PHUHP的物理圖譜；B：重組質(zhì)粒Ts-PDCm-URA3的物理圖譜。

圖2 PDC基因敲除流程圖

按照文獻(xiàn)[22]方法測定熱帶假絲酵母的PDC酶活。吸取2.7 mL檸檬酸緩沖液(200 mmol/L，pH6.0)、100 μL丙酮酸鈉溶液(1 mol/L)，50 μL β-NADH溶液(6.4 mmol/L)以及50 μL乙醇脫氫酶溶液(200 U/mL)于比色皿中混合均勻，作為實(shí)驗(yàn)組；吸取2.8 mL檸檬酸緩沖液(200 mmol/L，pH6.0)和100 μL丙酮酸鈉溶液(1 mol/L)于比色皿中混合均勻作為空白對照組。兩者經(jīng)30℃保溫5 min后，放入分光光度計(jì)，分別加入100 μL經(jīng)適當(dāng)稀釋的細(xì)胞抽提物，迅速混合均勻，在波長340 nm處測定吸光值，每30 s記錄一次數(shù)據(jù)，共測定3 min。計(jì)算每分鐘吸光值的減少量，據(jù)此計(jì)算PDC比酶活。蛋白濃度用考馬斯亮藍(lán)染色法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿嘧啶缺陷型突變株的篩選

以熱帶假絲酵母ATCC 20336為出發(fā)菌株，經(jīng)過11次誘變和FOA選擇培養(yǎng)基篩選，先后共挑取127株單菌落進(jìn)行營養(yǎng)缺陷型驗(yàn)證。將長出的菌落分別點(diǎn)種SM和MM培養(yǎng)基平板并進(jìn)行突變株穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終鑒別出13株ura3/ura3突變株，選擇其中3株，分別命名為C. tropicalis XZW、C. tropicalis XZX、C. tropicalis XZB。將原始菌株與3株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株分別劃線于SM平板和MM培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)4 d，生長狀況如圖3所示。突變株在MM培養(yǎng)基平板上不生長，而在 SM培養(yǎng)基平板上能夠正常生長。

分別提取熱帶假絲酵母突變株 XZW、XZX、XZB的染色體DNA，PCR擴(kuò)增獲得突變株的URA3基因片段進(jìn)行 DNA測序，并與來源于野生型菌株ATCC20336的URA3基因序列和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較，結(jié)果見表 2。菌株 XZW 的氨基酸序列中，第203位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，?261位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、?265位的谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼幔痪闤ZX的氨基酸序列中，第8位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，?5位的亮氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，?03位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼幔痪闤ZB的氨基酸序列中，第 203位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?、?61位的賴氨酸突變?yōu)榫彼?、?265位的谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼帷Ｆ涔灿械耐蛔優(yōu)榈?03位的甘氨酸突變?yōu)樘於彼?，由此推測，第203位的甘氨酸可能是該酶的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，突變會(huì)導(dǎo)致該酶功能失活。

2.2 PDC基因敲除突變盒的構(gòu)建

分別構(gòu)建重組質(zhì)粒Ts-PHUHP(圖1A)和Ts-PDCm-URA3(圖1B)。重組質(zhì)粒Ts-PHUHP經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切作用后，凝膠電泳顯示存在3.5 kb和3.9 kb的 DNA條帶，分別與 PDC1-Ts-PDC1片段和 hisGURA3-hisG片段大小一致(圖4A)；利用EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶作用于重組質(zhì)粒，分別得到4.7 kb和2.7 kb的DNA條帶，與預(yù)期的hisG-PDC1-Ts-PDC1和URA3-hisG片段大小一致(圖4A)。結(jié)果表明基因敲除表達(dá)盒PHUHP構(gòu)建成功。

利用EcoRⅠ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切重組質(zhì)粒Ts-PDCm-URA3后，凝膠電泳顯示釋放出3.2 kb和1.6 kb的兩個(gè)DNA片段，分別與預(yù)期的PDCm-Ts-PDCm片段和URA3基因大小一致(圖4B)。表明成功構(gòu)建了第二個(gè)基因敲除表達(dá)盒MUM。

2.3 熱帶假絲酵母PDC基因的敲除

PCR擴(kuò)增基因敲除表達(dá)盒PHUHP(DNA結(jié)構(gòu)示意圖如圖2A所示)并轉(zhuǎn)化熱帶假絲酵母XZX宿主，涂布 MM培養(yǎng)基平板。將長出的單菌落轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，提取其染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。用引物PDC-F1和PDC-R1擴(kuò)增，獲得4.7 kb的DNA片段條帶和1.7 kb的DNA條帶(圖5A)，測序發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)條帶分別與PHUHP片段和PDC基因序列完全一致。而出發(fā)菌株C. tropicalis XZX的PCR結(jié)果僅有1.7 kb的PDC基因條帶出現(xiàn)(圖5A)。同時(shí)，用引物URA3-F和PDC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得了3.1 kb的 DNA片段(圖 5B)，測序結(jié)果表明該片段與URA3-hisG- PDC1片段的序列完全一致。因此，可以確認(rèn)基因敲除表達(dá)盒 PHUHP正確整合到染色體的PDC基因位點(diǎn)，其整合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)如圖2B所示。該轉(zhuǎn)化子命名為C. tropicalis XZX02。實(shí)驗(yàn)共挑取了19個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其中14個(gè)成功整合在PDC基因位點(diǎn)，整合陽性率達(dá)74%(數(shù)據(jù)未列出)。

圖3 原始株和突變株在MM(左)和SM(右)平板上的生長狀況比較A: C. tropicalis ATCC20336; X: C. tropicalis XZX; W: C. tropicalis XZW; B: C. tropicalis XZB。

表2 熱帶假絲酵母營養(yǎng)缺陷菌株的URA3基因突變位點(diǎn)

圖4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定A: Ts-PHUHP的酶切驗(yàn)證。1: Ts-PHUHP/EcoRⅠ+PstⅠ; 2: Ts-PHUHP/ EcoRⅠ+SalⅠ; M: DL 5000 DNA marker。B: Ts-PDCm-URA3的EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切驗(yàn)證。1: 酶切條帶; M: DL 5000 DNA marker。

為獲得 URA3標(biāo)記基因從轉(zhuǎn)化子 C. tropicalis XZX02染色體的 PDC基因位點(diǎn)丟失的突變株，將培養(yǎng)后的XZX02細(xì)胞涂布于2×FOA平板上，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。用引物PDC-F1和PDC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別獲得2 kb的DNA片段和1.7 kb的DNA片段(圖5A)，經(jīng)DNA測序分析表明其分別為PDC1-hisG-PDC1片段序列和PDC基因序列。進(jìn)一步用引物URA3-F和PDC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒有產(chǎn)物出現(xiàn)(圖 5B)。推測原因可知，由于 PHUHP片段中的URA3基因和一個(gè)拷貝hisG序列在DNA復(fù)制過程中從染色體上丟失，引物對無法有效結(jié)合靶序列導(dǎo)致了該 PCR反應(yīng)沒有特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。PCR鑒定結(jié)果確認(rèn)篩選培養(yǎng)基上長出的單菌落細(xì)胞中插入于PDC基因位點(diǎn)的URA3標(biāo)記基因已經(jīng)丟失，丟失URA3基因后的突變株命名為C. tropicalis XZX03，染色體上PDC基因位點(diǎn)附近的遺傳結(jié)構(gòu)如圖2C所示。

以菌株C. tropicalis XZX03為宿主，將第二個(gè)PDC基因刪除表達(dá)盒MUM片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，涂布MM培養(yǎng)基平板，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。用引物PDC-F1和PDC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得2 kb的DNA片段和3 kb DNA片段(圖5A)，大小分別與PDC1-hisG-PDC1片段和包含PDCm-URA3-PDCm的DNA片段一致，DNA測序進(jìn)一步驗(yàn)證了該推測的正確性。用引物URA3-F和PDC-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2.2 kb的DNA片段，DNA測序表明包含URA3-PDCm片段的序列。結(jié)果表明宿主的第二個(gè)PDC等位基因被 MUM 片段所替代，該突變株命名為 C. tropicalis XZX04，染色體上PDC基因結(jié)構(gòu)如圖2E所示。另外，評(píng)價(jià)了第二個(gè)PDC基因的敲除效率。從MM培養(yǎng)基平板分別挑取12株單菌落，經(jīng)PCR及DNA測序驗(yàn)證其中6個(gè)單菌落細(xì)胞的PDC第二個(gè)等位基因被 MUM片段所取代，定點(diǎn)整合效率達(dá)50%(數(shù)據(jù)未列出)。

圖 5 尿嘧啶缺陷株 XZX、突變株 XZX02、XZX03和XZX04的PCR驗(yàn)證A：以PDC-F1和PDC-R1為引物，各菌株染色體DNA為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證。1: C. tropicalis XZX; 2: C. tropicalis XZX02; 3: C. tropicalis XZX03; 4: C. tropicalis XZX04; M: DL 5,000 DNA marker。B：以URA3-F和PDC-R1為引物，各菌株染色體DNA為模板進(jìn)行 PCR驗(yàn)證。1: C. tropicalis XZX; 2: C. tropicalis XZX02; 3: C. tropicalis XZX03; 4: C. tropicalis XZX04; M: lambda DNA/PstI marker。

2.4 熱帶假絲酵母 C. tropicalis(pdc/pdc)突變株的表型鑒定

圖6 原始菌株ATCC20336及衍生菌株在SM平板(左)和MM平板(右)上的生長狀況比較1: C. tropicalis ATCC 20336; 2: C. tropicalis XZX; 3: C. tropicalis XZX02; 4: C. tropicalis XZX03; 5: C. tropicalis XZX04。

將原始菌株 ATCC 20336、尿嘧啶缺陷株 C. tropicalis XZX、突變株 C. tropicalis XZX02、C. tropicalis XZX03和C. tropicalis XZX04分別劃線于SM平板和MM平板上，觀察其生長狀況，如圖6所示。在 SM培養(yǎng)基平板上，所有熱帶假絲酵母菌株均能正常生長。當(dāng)劃線接種于MM培養(yǎng)基平板上時(shí)，僅有C. tropicalis ATCC 20336、轉(zhuǎn)化子C. tropicalis XZX02和C. tropicalis XZX04具有相似的生長表型，而營養(yǎng)缺陷株C. tropicalis XZX和轉(zhuǎn)化子C. tropicalis XZX03不能正常生長形成肉眼可見的菌落。生長表型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了不同轉(zhuǎn)化子PDC基因位點(diǎn)的重組特征及二倍體細(xì)胞中兩個(gè)PDC基因拷貝的敲除。

2.5 PDC基因缺失的功能鑒定

為了考察 PDC基因的缺失對突變株中酶活力的影響，分別測定了尿嘧啶缺陷型菌株C. tropicalis XZX、突變株 C. tropicalis XZX02、C. tropicalis XZX03和C. tropicalis XZX04的胞內(nèi)PDC酶活力，結(jié)果如圖7所示。C. tropicalis XZX的酶活最高，PDC基因單拷貝敲除菌株 C. tropicalis XZX02和 C. tropicalis XZX03的PDC比酶活相似，分別比出發(fā)菌株C. tropicalis XZX下降了20.56%和20.00%。PDC基因雙拷貝敲除菌株 C. tropicalis XZX04的PDC比酶活相比出發(fā)菌株C. tropicalis XZX則下降了 43.60%。結(jié)果表明 PDC基因的敲除顯著降低了胞內(nèi)PDC酶活。但同時(shí)可以看到，即使PDC基因兩個(gè)拷貝都敲除的 C. tropicalis XZX04胞內(nèi)，仍有 56.30%的 PDC酶活。通過對熱帶假絲酵母基因組DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，該酵母細(xì)胞中存在著至少3個(gè)編碼PDC的同工酶基因。因此，我們推測突變株XZX04中 PDC同工酶提供了胞內(nèi)相應(yīng)的酶活并能在一定程度上功能互補(bǔ)缺失基因。

圖7 熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)PDC酶活分析XZX: C. tropicalis XZX; XZX02: C. tropicalis XZX02; XZX03: C. tropicalis XZX03; XZX04; C. tropicalis XZX04。

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了一種適用于熱帶假絲酵母的基因敲除系統(tǒng)。熱帶假絲酵母是一種二倍體酵母，其每一個(gè)雙拷貝基因的敲除，都需要構(gòu)建兩個(gè)不同的突變盒，以保證兩個(gè)拷貝基因的徹底破壞，獲得該基因缺失的純合子突變株。如果每個(gè)突變盒都需要一個(gè)不同的標(biāo)記基因進(jìn)行多基因敲除時(shí)，尋找合適的標(biāo)記基因會(huì)變得十分困難。因此，重復(fù)利用同一選擇性標(biāo)記進(jìn)行多基因的刪除是切實(shí)可行的策略。在染色體DNA復(fù)制過程中，兩個(gè)近距離的重復(fù)片段會(huì)發(fā)生同源重組現(xiàn)象。在構(gòu)建基因刪除表達(dá)盒過程中，將來源于沙門氏菌的 hisG序列分別同向插入U(xiǎn)RA3基因的兩側(cè)，并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在DNA復(fù)制過程中，整合于宿主染色體上的hisG-URA3-hisG結(jié)構(gòu)的DNA片段會(huì)發(fā)生hisG序列的重組從而剪切掉URA3基因和一個(gè)拷貝的hisG片段導(dǎo)致重組位點(diǎn)僅留下一個(gè)hisG片段[20]。利用這種同源重組原理，以“轉(zhuǎn)化宿主菌、剔除URA3基因、更換同源臂再次轉(zhuǎn)化宿主菌”的循環(huán)操作，能夠?qū)崿F(xiàn)對酵母的多個(gè)靶基因的連續(xù)敲除。

本研究重復(fù)利用 URA3基因作為選擇標(biāo)記，成功敲除了熱帶假絲酵母二倍體細(xì)胞的PDC基因，并對該基因功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證。PDC基因可在無氧條件將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛，并在乙醛脫氫酶的作用下進(jìn)一步代謝為酒精，是熱帶假絲酵母碳代謝途徑上的關(guān)鍵酶。另外，PDC基因的存在，可能還與假絲酵母的致病性有一定關(guān)聯(lián)[23]。作為對熱帶假絲酵母 URA3基因重復(fù)利用可行性的初步探索，本研究僅對一個(gè)基因的兩個(gè)拷貝進(jìn)行敲除，故第二個(gè)敲除突變盒中并未插入hisG重復(fù)序列，沒有對URA3基因進(jìn)行再次剔除。在實(shí)際應(yīng)用中，如需對多個(gè)不同基因進(jìn)行敲除，可在每一個(gè)敲除突變盒中均插入hisG重復(fù)序列，通過兩次篩選消除URA3基因，即可實(shí)現(xiàn) URA3標(biāo)記的多次重復(fù)利用。另外，本文還比較了醋酸鋰轉(zhuǎn)化法與氯化鋰轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明氯化鋰轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率較高(數(shù)據(jù)未列出)。

利用本研究建立的基因敲除系統(tǒng)能夠高效地敲除熱帶假絲酵母的目的基因，為菌株的代謝工程研究提供了技術(shù)手段，也可以作為其他酵母遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的借鑒。

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(責(zé)任編委: 呂 紅)

Development of a genetic transformation system for Candida tropicalis based on a reusable selection marker of URA3 gene

Zheng Xiang1, Xianzhong Chen1, Lihua Zhang1, Wei Shen1, You Fan1, Maolin Lu2

1. Key Lab of Industrial Biotechnology, Education Ministry, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
2. Jiangsu Institute of Microbiology Co. Ltd., Wuxi 214063, China

Candida tropicalis, a diploid asporogenic yeast, is frequently utilized in industrial applications andresearch studies. However, the low efficiency of genetic transformation limits the strain improvement by metabolic engineering. A reliable transformation and efficient deletion of target gene are prerequisite for molecular improvement of C. tropicalis. In this study, an efficient approach for genetic transformation of C. tropicalis was developed based on the URA3 gene as a reusable selection marker and both of PDC allele genes encoding pyruvate decarboxylase were successfully deleted by this approach. Firstly, an auxotrophic mutant strain of C. tropicalis XZX which is defective in orotidine-5′-phosphate decarboxylase (URA3) was isolated by chemical mutagenesis combined with nystatin enrichment selection and 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) resistance selection using C. tropicalis ATCC 20336 as the parent strain. Then, the first PDC deletion cassette PDC1-hisG-URA3-hisG- PDC1 (PHUHP) which contains a 1.6 kb URA3 marker gene, two copies of 1.1 kb Salmonella hisG fragments and homologous arms of target gene was constructed and transformed into C. tropicalis XZX cells. Transformants with a single copy of PDC deleted were isolated and identified by PCR and DNA sequencing, which was designated as C.tropicalis XZX02. The C.tropicalis XZX02 cells were spread on the minimal medium containing 5-FOA to generate mutant C. tropicalis XZX03 in which URA3 marker gene was excised from PHUHP fragment integrated into the PDC gene site. The second PDC gene deletion cassette PDCm-URA3-PDCm (MUM) was constructed and transformed into C. tropicalis XZX03 to generate C.tropicalis XZX04 in which both of PDC allele genes were deleted. All strains were confirmed by PCR and DNA sequencing. This efficient genetic transformation approach laid a foundation for further metabolic engineering of C. tropicalis.

Candida tropicalis; genetic transformation; homologous recombination; URA3 gene; gene disruption

2014-04-11;

2014-06-10

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：BE2012618)資助

項(xiàng)崢，碩士研究生，專業(yè)方向：微生物遺傳育種。E-mail: wq5513031@126.com

陳獻(xiàn)忠，博士，副教授，研究方向：微生物遺傳育種與代謝工程。E-mail: xzchen@jiangnan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.1053

時(shí)間: 2014-9-24 10:35:09

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140924.1035.003.html