劉春，李瓊艷，荀利杰，胡文波，呂金風，劉茹鳳，夏慶友

家蠶基因組生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部蠶桑重點實驗室，西南大學，重慶 400715

家蠶光澤小眼(varnished eye)突變基因的精細定位

劉春，李瓊艷，荀利杰，胡文波，呂金風，劉茹鳳，夏慶友

家蠶基因組生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部蠶桑重點實驗室，西南大學，重慶 400715

家蠶(Bombyx mori)光澤小眼(varnished eye，ve)突變體是家蠶突變品種中少數(shù)關于家蠶復眼形態(tài)異常的自然隱性突變品種之一，表現(xiàn)為成蟲復眼小，表面富有光澤，有瘤狀突起；小眼數(shù)量少且不規(guī)則。經(jīng)典遺傳學連鎖圖譜將ve基因定位在第6連鎖群32.2座位，但到目前為止，該突變性狀的形成機理仍不清楚。文章以突變品種ve和對照品種Dz為親本，雜交產(chǎn)生的F1代雄個體與輪回親本ve雌個體回交產(chǎn)生的BC1代為材料進行ve基因的精細定位。通過對ve低密度連鎖圖譜分析發(fā)現(xiàn)，ve基因被定位在SNP3～SNP6之間，物理圖譜距離大約為1.2 Mb。利用1563個BC1代個體構建ve高密度連鎖圖譜，最終將ve基因定位在SNP5～SNP61之間，物理圖譜距離大約為221.8 kb。通過家蠶基因數(shù)據(jù)庫對ve最終定位區(qū)域內(nèi)進行預測基因檢索，發(fā)現(xiàn)有6個預測基因。對6個預測基因進行生物信息學分析和測序，這些候選基因都有可能參與家蠶復眼形成，但在編碼區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)ve特異的突變位點；對這些候選基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)編號為BGIBMGA013642的候選基因在ve復眼形成過程中的表達量明顯比正常對照Dz低，推測該基因為最佳候選基因。

家蠶；光澤小眼；SNP標記；精細定位；候選基因

昆蟲視覺器官能夠感受波長范圍為253～700 nm的光波，光波受體細胞刺激產(chǎn)生生物電位，傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起視覺反應。一般昆蟲的視覺器官包括單眼和復眼兩種，單眼的視覺中心位于單眼柄頂端內(nèi)，復眼的視覺中心位于視葉。昆蟲的視覺器官對昆蟲的覓食、求偶、休眠、滯育、避害、決定行為方向等都起著重作用[1～3]。

家蠶是一個完全變態(tài)昆蟲，一生經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲 4個發(fā)育階段。家蠶幼蟲期視覺器官由 6對單眼組成，成蟲期視覺器官由一對復眼組成。家蠶成蟲復眼黑色，由3000多個規(guī)則的六角形小眼排列成蜂窩狀結構。每個小眼由角膜、晶錐、色素細胞、感桿束和視神經(jīng)等結構組成[4]，并且這些組成和果蠅、哺乳動物以及人類視覺系統(tǒng)基本組成具有較高的相似性。家蠶有許多關于復眼的突變體，大多數(shù)是與色素相關的眼色突變體，如第1白卵(w-1)，復眼白色[5,6]；第2白卵(w-2)，復眼白色[7]；第3白卵油蠶(w-3oe)[8,9]，復眼白色；第5白卵(w-5)，復眼紅色[10]；紅眼紅卵(red egg, re)，復眼深赤褐色[11]等突變體；而且，大部分突變基因已經(jīng)被相繼克隆鑒定，其突變機理也被闡明。目前，關于家蠶復眼眼形突變的突變體只有兩種，光澤眼(lustrous, lu)和光澤小眼(varnished eye, ve)，經(jīng)典遺傳學分析將lu突變基因定位在家蠶第16連鎖群0.0座位，將ve突變基因定位在家蠶第6連鎖群32.2座位[12,13]，這兩個突變體都是由單基因控制的的隱性突變。

家蠶光澤小眼突變體的表型為成蟲復眼小，表面富有光澤，小眼形狀不規(guī)則、成瘤狀突起、數(shù)量顯著減少。本實驗室通過前期的形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)ve復眼的突變不僅表現(xiàn)在外部形態(tài)，復眼內(nèi)部結構也發(fā)生巨大的變化。與正常復眼相比，相應的角膜、晶錐、感桿束及色素細胞都發(fā)生了變化[14]。但目前為止，其突變基因及突變機理還未知。因此，本研究利用SNP標記對ve突變基因進行了精細定位，希望能克隆鑒定ve突變基因，進而闡明ve的突變機理，為家蠶和昆蟲的視覺器官的變態(tài)發(fā)育研究提供參考，同時為人類眼疾病研究提供信息。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗所用的正常蠶品種Dz及突變品系ve復眼表型如圖 1所示。用于驗證突變位點特異性的其他蠶品種及突變品種，包括碧波、C108、綿繭、狹胸、黑縞、鶉斑、伴性赤蟻、夏芳、縮蠶及裸蛹等蠶卵均由西南大學家蠶基因庫提供，分別按常規(guī)桑葉育進行飼養(yǎng)。

圖1 正常蠶蛾復眼和ve突變蠶蛾復眼比較圖

1.2 方法

1.2.1 ve定位材料的配置

本研究以ve突變個體和Dz對照個體為親本，雜交F1代雄個體與輪回親本ve雌個體回交，產(chǎn)生的BC1代為材料進行精細定位。整個材料飼養(yǎng)及配置由西南大學家蠶基因資源庫提供。所有材料收集、統(tǒng)計、貼上標簽后保存于-80℃冰箱中保存，材料統(tǒng)計結果見表1。

表1 所用材料數(shù)目統(tǒng)計

1.2.2 基因組DNA提取

家蠶基因組的提取方法按 DNA自動提取儀(Kurobo-PI1200，日本)提取小鼠尾巴基因組DNA的提取方案說明書進行。樣品DNA溶解在TE，利用分光光度計抽樣檢測基因組DNA濃度和純度，并利用家蠶看家基因核糖體蛋白L3(ribosomal protein L3 of Bombyx mori，Bmrp3)基因引物(正向引物：CGGTGTTGTTGGATACATTGAG；反向引物：GCTCATCCTGCCATTTCTTACT)調整基因組DNA的最適模板濃度，便于后期大規(guī)模篩選SNP標記。

1.2.3 SNP標記的篩選

從已構建的家蠶SNP 分子標記連鎖圖中的第6連鎖群中等間距挑取SNP標記[15,16]，以兩個親本和F1個體為模版進行PCR擴增反應。PCR擴增體系(10 μL)：1 μL 10×r Tag buffer； 2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL；rTag (TaKaRa) 0.1μL，2 μL基因組模板；2 μmol/L引物(F/R) 2 μL；4.1 μL ddH2O。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；最后再72℃延伸5 min。經(jīng)電泳檢測后存在片段長度多態(tài)性的直接用于下一輪連鎖分析；對片段長度沒有差異的則直接進行PCR產(chǎn)物測序。PCR產(chǎn)物首先利用SAP酶和核酸外切酶Ⅰ按試劑說明書進行消化處理，然后利用 BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 進行測序PCR反應，并利用無水乙醇進行純化，最后利用3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems)進行測序。測序反應按 ABI3700儀器 PCR產(chǎn)物測序操作說明進行。利用 Sequener 4.0軟件對序列進行 SNP位點的鑒定和分析，篩選出可用的SNP標記。本實驗用于定位的SNP標記引物信息見表2。

表2 ve精細定位所用SNP標記引物及在日本家蠶基因組數(shù)據(jù)中的位置

1.2.4 家蠶ve基因連鎖定位

將篩選出的SNP標記，利用BC1中92個個體進行SNP分析，構建ve低密度遺傳連鎖圖譜。利用與表型最緊密連鎖的2個SNP標記進行大規(guī)模BC1群體(1563個個體)的基因型分析，篩選交換個體；同時，在最緊密連鎖的兩個SNP標記間根據(jù)家蠶遺傳多態(tài)性圖譜設計新的引物，發(fā)展新的 SNP標記，構建目標基因ve的高密度遺傳連鎖圖譜。

1.2.5 ve連鎖區(qū)域內(nèi)候選基因分析

利用西南大學家蠶基因組數(shù)據(jù)庫 SilkDB(http: //silkworm.swu.edu.cn/silkdb)和日本基因組數(shù)據(jù)庫(http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKObase/)對連鎖區(qū)域進行基因檢索并下載候選基因序列。利用家蠶數(shù)據(jù)庫和Pfam在線預測候選基因編碼蛋白質結構域。

1.2.6 ve候選基因的測序鑒定及表達差異比較

為了比較候選基因的表達差異，收集Dz和ve5齡第 3 d及上蔟至化蛾期材料，利用 Triozl(Roche)試劑提取頭部RNA，提取方法參考試劑說明書進行。采用反轉錄試劑盒(Promega)對純化后的 RNA進行cDNA合成。根據(jù)候選基因序列設計引物進行cDNA擴增，并進行測序鑒定；同時進行表達差異分析。反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，共35(30)個循環(huán)；最后72℃ 5 min。對測序分析出Dz和ve有氨基酸差異的突變位點在碧波、C108、綿繭、狹胸、黑縞、鶉斑、伴性赤蟻、夏芳、縮蠶及裸蛹10個蠶品種基因組中進行序列突變特異性鑒定。候選基因測序及表達譜分析所用引物序列見表3。

表3 ve候選基因鑒定所涉及的引物名稱及序列

引物編號 基因編號 引物序列(5′→3′)ve-can3-F2BGIBMGA013643ATTCGGGAAGGTCTAGTTTGve-can3-R1BGIBMGA013643TTTTGGCTAAATAACACTTCACve-can3-R2BGIBMGA013643TTTTGGCTAAATAACACTTCACve-can4_F1BGIBMGA013642TTTTATCGTCCATCATTCGTGve-can4_F2BGIBMGA013642GCCGCTGCTTTTATTGGTATve-can4_F3BGIBMGA013642AAAGAGTTGGAGGATTCGTCGve-can4_F4BGIBMGA013642ATGAAAACCGAAGACGAAAGAACve-can4_F5BGIBMGA013642GTGTATGCTTACCTCGGCGAve-can4_F6BGIBMGA013642TCTGTCTCCGTGTTCCCGATve-can4_R1BGIBMGA013642TTATGTTCTGATCGGTCGAGTCve-can4_R2BGIBMGA013642TCCTGAGCACAGCGAGACTATve-can4_R3BGIBMGA013642ACCTGTAACCGTAGCAGTCTTGAve-can4_R4BGIBMGA013642 GATAGCCCCACAAGAACGACve-can4_R5BGIBMGA013642GTGGCTTGAACATTAGGGCAve-can4_R6BGIBMGA013642AACCGTGAAGGCTGTTTGACve-can5_F1BGIBMGA013574GTCAGACGTATCGCGTGTTCCBGIBMGA013574 ve-can5_F2TTGGAGGTTGCTCATCATCGve-can5_F3BGIBMGA013574CACGAGGCGAATGTTGTAGTve-can5_R1BGIBMGA013574ATTTCCTGTTGCTTCCGTATGAve-can5_R2BGIBMGA013574GCTTTCGCTTTCTAGTACTTCAGve-can5-F4BGIBMGA013574GGGCAGGAGTTCGGCATTCAve-can5-R3BGIBMGA013574TAAGAAGCAAGGATGATACCAAve-can5-R4BGIBMGA013574TTCCCTTCAGCACCTCCATAGCve-can5-R5BGIBMGA013574GATACTTTACCATTATTTACTAve-can6_F1BGIBMGA013641TTTTGTTAGTGTAAATGTGCCTTve-can6_F2BGIBMGA013641AAAGCACCGTTCCAGACTACAve-can6_F3BGIBMGA013641AACGATTACTTTGCTGATGGGve-can6_F4BGIBMGA013641ATTTACTCGTGGAGGTTGTTCve-can6_F5BGIBMGA013641ATGCCACTATGGATGACGAGve-can6_F6BGIBMGA013641CTGCTCCAACTCCAACAAGATAve-can6_R1BGIBMGA013641ACACGAAAAGTATGAGACTGGATTve-can6_R2BGIBMGA013641GCTGCTACGGCAATAAAAGGve-can6_R3BGIBMGA013641ATTAATCGATTTATTCTTGCAGTve-can6_R4BGIBMGA013641CTACATGTAAGTTGATATGTATve-can6_R5BGIBMGA013641CACTCCTGATGCGAAGAAAGve-can6_R6BGIBMGA013641AACAAAACTCATTCCCACCAve-can6_R7BGIBMGA013641TTGTCTTCTTCTTTTCGCGT

2 結果與分析

2.1 SNP標記的篩選

本研究所用的標記為 SNP標記，目前已知的SNP標記是基于 Dz與 C108之間的分子標記[15,16]，這些分子標記是否存在于ve與Dz兩品種之間需進行進一步的實驗驗證。因此，本研究對SNP標記進行了電泳篩選和測序篩選。利用電泳篩選主要是去除不能在親本間獲得PCR產(chǎn)物的或者PCR產(chǎn)物不理想的SNP標記；對于PCR產(chǎn)物在兩品種間具有片段長度多態(tài)性的，則直接利用電泳檢測的方法對 BC1代進行基因分型。對于沒有片段長度的PCR產(chǎn)物則進入測序分析；通過電泳檢測和測序分析，發(fā)現(xiàn)檢測的38個SNP標記中有20個在Dz和ve中存在PCR產(chǎn)物長度多態(tài)性或者SNP位點，可以用于下一步實驗。

2.2 ve突變基因的精細定位

根據(jù)可用SNP標記在染色體上的位置，選擇了10個SNP標記(圖2A)和92個回交個體構建低密度連鎖圖譜。將電泳和測序結果統(tǒng)計在excel表中，排序整理，刪除未發(fā)生交換、雙交換，構建獲得低密度連鎖圖譜。通過對圖譜的分析，發(fā)現(xiàn)ve被鎖定在SNP3和SNP6標記之間，物理距離約為1.2 Mb(圖2B)。為了更進一步縮小ve的連鎖區(qū)域，對低密度連鎖圖譜區(qū)域重新開發(fā)新的 SNP標記，獲得可用的 SNP標記8個。利用1563個回交個體構建ve高密度連鎖圖譜，最終將ve突變基因鎖定在SNP5和SNP61兩個分子標記之間，物理圖距為221.8 kb(圖2C)。

2.4 連鎖區(qū)域候選基因分析和鑒定

利用西南大學家蠶基因組數(shù)據(jù)庫 SilkDB(http: //silkworm.swu.edu.cn/silkdb)和日本基因組數(shù)據(jù)庫(http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKObase/)對 ve的最小連鎖區(qū)域進行基因檢索，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域有 6個預測基因(圖2C)。利用家蠶數(shù)據(jù)庫和在線軟件Pfam對候選基因進行蛋白質結構域分析，結果如表4所示。

表4 ve連鎖區(qū)域候選基因及編碼蛋白結構域分析

表5 預測基因在ve與Dz品種間的突變位點分析

根據(jù)基因注釋分析得出ve-can-1基因編碼鈣粘蛋白，參與細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質之間相互粘連過程；ve-can-2無任何功能注釋；ve-can-3基因編碼HLH類型的轉錄調控因子，對生長發(fā)育起調控作用；ve-can-4、ve-can-5及ve-can-6都編碼突出囊泡蛋白，在細胞轉運膜泡運輸當中起重要作用。對上述 6個候選基因編碼區(qū)進行測序，發(fā)現(xiàn)大部分基因都存在單堿基的變化。將其翻譯成蛋白序列，發(fā)現(xiàn)有3個基因存在單個或者多個氨基酸的變化(表5)。為了驗證這些氨基酸的變化是否在 ve中特異存在，利用 10個其他復眼正常的品種進行進一步的測序研究，測序結果表明這些突變位點都不是ve唯一的(表5)。對這些候選基因進行了表達差異比較，發(fā)現(xiàn)ve-can-4(BGIBMGA013642)基因在ve復眼形成時期表達量較正常低(圖 3)，將其認為是 ve的最佳候選基因。

圖3 ve-can-4基因在Dz和ve復眼形成期的表達情況1：5齡第3 d；2：剛上簇；3：上簇第1 d； 4：上簇第2 d；5：剛化蛹；6：化蛹第1 d；7：化蛹第2 d；8：化蛹第3 d；9：化蛹第4 d；10：化蛹第5 d；11：化蛹第6 d；12：化蛹第7 d。

3 討 論

本研究通過基于SNP標記的定位克隆技術將家蠶ve基因定位在了第6染色體的SNP5和SNP61兩個分子標記之間，物理距離約為 221.8 kb，對定位區(qū)域內(nèi)染色體序列進行了信息學分析發(fā)現(xiàn)在這個定位區(qū)域內(nèi)有6個預測基因。本文對這6個預測基因進行了結構預測和功能分析，發(fā)現(xiàn)這 6個基因都有可能參與眼的形成。對 6個預測基因編碼區(qū)進行測序，卻未發(fā)現(xiàn)ve特異的氨基酸序列變化。本研究對候選基因進行了蛹期表達譜分析，從每個基因表達譜結果發(fā)現(xiàn)BGIBMGA013642基因表達量在ve中顯著降低，可能與 ve的突變表型有關。2009年，Catherine等[17]在小鼠中對BGIBMGA013642基因的同源基因SV2B進行基因敲除實驗，敲除后小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育異常，推測 BGIBMGA013642基因在家蠶眼部發(fā)育也起著重要作用，是最佳的候選突變基因。

從目前家蠶定位克隆研究進展可以看出，導致家蠶突變的原因形形色色，既有大片段序列的插入或缺失，又有單堿基的改變；既有編碼區(qū)域序列的改變，又有非編碼區(qū)域序列的改變；既有基因改變導致的蛋白功能的變化或喪失，又有基因表達量的降低導致編碼蛋白功能不足等等。根據(jù)ve的候選基因分析情況，推測有可能其突變位點發(fā)生在基因的非編碼區(qū)，即基因的啟動子、內(nèi)含子或者UTR區(qū)域。這些區(qū)域的變化雖然不會引起蛋白結構的變化，但會導致基因表達量的變化，同樣也會因為蛋白表達量不夠而引起形態(tài)上的變化；同時，也不排除另一種可能，在鎖定區(qū)域內(nèi)，還有未被預測的基因或者基因組序列在該區(qū)域被組裝錯誤，導致基因預測不完全。Quiring等[18]證實，果蠅的 eyeless基因和小鼠的small eye基因以及人類的aniridia基因屬于同源基因，其突變性狀具有很高的相似性，并且證實這3個基因屬于pax-6基因家族成員，而它們的功能主要是控制眼睛的發(fā)育[19]。Kawguchi等[20]推測ve突變可能是由于pax-6基因突變引起。本研究對家蠶pax基因家族進行分析后發(fā)現(xiàn)，編號為BGIBMGA-009545與eyeless基因同源，然而BGIBMGA0009545基因卻未被成功定位到染色體上。因此，下一步我們將對該基因進行分析，確定其是否在二者間發(fā)生了變化。

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(責任編委: 黃 原)

Fine mapping of the mutant gene varnished eye in the silkworm

Chun Liu, Qiongyan Li, Lijie Xun, Wenbo Hu, Jinfeng Lv, Rufeng Liu, Qingyou Xia

State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, the Key Sericultural Laboratory of the Ministry of Agriculture, Southwest University, Chongqing 400715, China

The varnished eye (ve) mutant is one of the rare natural recessive mutants related to the abnormal phenotypes in the compound eye of silkworm (Bombyx mori). The compound eyes of the ve adults are smaller and glossier than those of the wild-type Dazao (Dz) and many tumor-like bumps are present on their surface; their small eyes are irregularly arranged and are smaller and fewer than those of the wild-type. The mutant gene ve has been located at the 32.2 locus of chromosome 6 in the classic genetic linkage map. However, it still remains unknown about the mechanism responsible for the mutant. In this study, we got a BC1generation using male F1(ve×Dz) with female ve for fine mapping of this mutant gene. The results showed that ve was located in a region between SNP3 and SNP6. The physical distance is approximately 1.2 Mb in the low densitylinkage map. By constructing a high-density map using 1563 BC1individuals, the ve mutant gene was further mapped into a region between the SNP5 and SNP61. The physical region is about 221.8 kb and contains six potential genes but no specific mutations were found in the CDSs of these candidate genes. RT-PCR showed that the expression of BGIBMGA013642 was decreased obviously compared with that in wild type, suggesting it might be a key candidate gene for further studying the ve mutant.

silkworm (Bombyx mori); varnished eye; SNP marker; fine mapping; candidate genes

2014-03-26;

2014-06-03

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(編號：2013AA102507)，教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目(編號：NCET-11-0699)和國家自然科學基金面上項目(編號：31372380)資助

劉春，博士，研究方向：家蠶功能基因組生物學。E-mail: mlliuchun@163.com

夏慶友，教授，博士生導師，研究方向：家蠶基因組生物學。E-mail: xiaqy@swu.edu.cn

致 謝: 特別感謝家蠶基因組生物學國家重點實驗室的代方銀教授為本實驗提供實驗材料。

10.3724/SP.J.1005.2014.1006

時間: 2014-9-2 10:38:24

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140911.1046.002.html