宿英，龍毅，阮國(guó)榮,2，吳麗花，張志燕，肖石軍，鄧瑋蕓，呂顯山，胡豆，吳國(guó)灶，沈虎群，廖信軍,3，丁能水，黃路生

1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南昌 330045；

2. 福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119；

3. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安 343009

利用傳遞不平衡分析在多群體中鑒別豬臍疝易感基因

宿英1，龍毅1，阮國(guó)榮1,2，吳麗花1，張志燕1，肖石軍1，鄧瑋蕓1，呂顯山1，胡豆1，吳國(guó)灶1，沈虎群1，廖信軍1,3，丁能水1，黃路生1

1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)物生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，南昌 330045；

2. 福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119；

3. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安 343009

在本實(shí)驗(yàn)室前期利用白色杜洛克×二花臉F2資源家系開(kāi)展臍疝易感位點(diǎn)全基因組掃描定位的基礎(chǔ)上，文章在7號(hào)染色體上的SWR1928和10號(hào)染色體上的SW830易感標(biāo)記區(qū)域，結(jié)合臍疝發(fā)病機(jī)制在多群體中進(jìn)行臍疝位置功能候選基因的篩選和易感位點(diǎn)的精細(xì)定位。在兩個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的微衛(wèi)星位點(diǎn)區(qū)域搜尋到 12個(gè)位置功能候選基因，采用比較測(cè)序法，選取12個(gè)候選基因內(nèi)共計(jì)40個(gè)SNP位點(diǎn)在白色杜洛克×二花臉資源家系F2/F3臍疝群體中進(jìn)行基因分型，利用Plink v1.07軟件對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和傳遞不平衡(Transmission disequilibrium test，TDT)分析。結(jié)果表明，IL16(Interleukin 16)基因中的g.708C＞T位點(diǎn)和CDC73(Cell division cycle 73)基因中的 g.10664G＞A位點(diǎn)與臍疝的關(guān)聯(lián)性達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)在西方商業(yè)豬種臍疝患病家系中進(jìn)行基因分型和TDT驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)CDC73基因中的g.10664G＞A位點(diǎn)仍與豬臍疝呈顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。同時(shí)對(duì)CDC73基因中與資源家系臍疝呈弱相關(guān)的兩個(gè)SNP位點(diǎn)g.10546A＞G和g.10811A＞G在西方商業(yè)豬種中進(jìn)行TDT驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)與商業(yè)豬種臍疝發(fā)生的關(guān)聯(lián)性達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。根據(jù)文章的分析結(jié)果，結(jié)合臍疝發(fā)生的生理機(jī)制及CDC73基因的生物學(xué)功能，推測(cè)CDC73基因可能為豬臍疝發(fā)生的易感基因。

豬；臍疝；位置功能候選基因；TDT分析；CDC73

臍疝(Umbilical hernia，UH)是豬生產(chǎn)中最常見(jiàn)的生長(zhǎng)發(fā)育缺陷之一，主要表現(xiàn)為因疝環(huán)異常擴(kuò)大導(dǎo)致腹腔內(nèi)容物(如小腸)脫至皮下形成囊狀物，其發(fā)病率一般在0.13%～5%之間[1～5]，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失并降低豬只福利[3]。該疾患不但影響豬只體形外貌，而且妨礙生長(zhǎng)發(fā)育、降低飼料轉(zhuǎn)化率、損害種豬使用性能(一般不留作種用)、影響商品豬品質(zhì)。豬臍疝發(fā)生的病因復(fù)雜，主要有先天遺傳因素和后天環(huán)境因素，臍疝家系聚集性發(fā)病、品種間發(fā)病率和遺傳易感性差異提示遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[5]。通過(guò)表型選擇通常難以降低豬臍疝的發(fā)生率，因此分離和鑒別臍疝主效致病基因或與之緊密連鎖的分子標(biāo)記成為豬臍疝抗病育種的關(guān)鍵，對(duì)現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)具有十分重要的意義。同時(shí)，豬還是人類(lèi)疾病研究的極好模型，豬臍疝發(fā)生的分子遺傳機(jī)理研究也將推動(dòng)人類(lèi)臍疝(臍帶疝、臍膨出或腹壁疝)發(fā)生的分子遺傳解析。

臍疝發(fā)病的分子病理機(jī)制目前尚不清楚，但綜合人類(lèi)和小鼠腹壁缺陷發(fā)生機(jī)制、動(dòng)物胚胎發(fā)生及臍疝解剖學(xué)和病理學(xué)研究成果，臍疝發(fā)生可能與腹壁細(xì)胞增殖和凋亡紊亂[6～8]、上皮細(xì)胞-間葉細(xì)胞互作和表型轉(zhuǎn)化異常[9～11]以及膠原代謝紊亂[12～14]相關(guān)。

近年來(lái)，研究者普遍采用基因組掃描和全基因組關(guān)聯(lián)分析等策略對(duì)復(fù)雜疾病進(jìn)行相關(guān)基因及易感區(qū)域的鑒別。迄今為止，有關(guān)豬臍疝易感位點(diǎn)定位的研究?jī)H見(jiàn)于本實(shí)驗(yàn)室的前期報(bào)道，Ding等[15]利用涵蓋豬基因組范圍內(nèi)的194個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)F2資源家系臍疝群體進(jìn)行全基因組掃描，在12條染色體上鑒別到影響豬臍疝發(fā)生的易感位點(diǎn)。用傳遞不平衡分析(Transmission disequilibrium test，TDT)和非參數(shù)連鎖分析(Non-parametric linkage analysis，NPL)兩種方法同時(shí)檢測(cè)到 7號(hào)染色體(SSC7)上的SWR1928標(biāo)記和10號(hào)染色體(SSC10)的SW830標(biāo)記與臍疝發(fā)生呈顯著相關(guān)(P＜0.05)。Ron等[16]在一個(gè)臍疝發(fā)病率高達(dá)9.7%的荷斯坦奶牛家系中，利用覆蓋牛29條染色體的59個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)包含49頭臍疝患病個(gè)體在內(nèi)的 119頭奶牛進(jìn)行全基因組掃描及單倍型分析，最終將臍疝易感位點(diǎn)定位在牛8號(hào)染色體(BTA8)著絲粒附近的標(biāo)記 AR071/AR072與UWCA47之間，并在該區(qū)域內(nèi)篩選到功能候選基因GATA47，該基因的表達(dá)產(chǎn)物是 Ca2+/鈣調(diào)磷酸酶NF-AT通路中的信號(hào)元件，而NF-TA信號(hào)通路阻滯會(huì)影響小鼠臍環(huán)的形成[17]。小鼠的腹壁缺陷研究中，AP2-α家族基因及TGF-β家族基因敲除的小鼠胚胎均表現(xiàn)出不同程度的腹壁發(fā)育缺陷[10,18,19]。

本研究在SSC7和SSC10上兩個(gè)已定位的豬臍疝易感基因組區(qū)域內(nèi)篩選到 12個(gè)位置候選基因并據(jù)此開(kāi)發(fā) SNP標(biāo)記。在白色杜洛克×二花臉資源家系 F2/F3臍疝群體中對(duì)這些 SNP位點(diǎn)開(kāi)展相關(guān)性分析，顯著關(guān)聯(lián)的SNP在遠(yuǎn)緣商業(yè)臍疝群體中進(jìn)一步進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，從而錨定易感基因。本研究結(jié)果將有助于解析臍疝發(fā)生的分子病理機(jī)制，并為建立“抗臍疝”豬的分子育種提供重要參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及病理診斷

1.1.1 資源群體

資源家系臍疝群體中有 58個(gè)臍疝患病家系共計(jì)160個(gè)個(gè)體，其中臍疝患病個(gè)體75頭，每個(gè)家系患病個(gè)體數(shù)有1～6個(gè)不等。該群體是以2 頭白色杜洛克公豬和 17 頭二花臉母豬為祖代，隨機(jī)選取 9頭F1公豬和59頭F1母豬自群繁育(避免全同胞交配)產(chǎn)生1912頭F2個(gè)體，其中臍疝患病個(gè)體50頭，隨機(jī)選取F2代臍疝個(gè)體的正常全同胞公豬與母豬雜交繁育產(chǎn)生 F3，其中臍疝患病個(gè)體 25頭[15]。每頭患病個(gè)體詳細(xì)記錄系譜、性別并拍照留檔。因仔豬出現(xiàn)臍疝的發(fā)生是遺傳和環(huán)境共同作用的結(jié)果，因此臍疝表型判定均在豬只 21～72 d時(shí)由專(zhuān)業(yè)獸醫(yī)師進(jìn)行仔細(xì)判定，從而減小環(huán)境致病因素的干擾作用。

1.1.2 遠(yuǎn)緣群體

遠(yuǎn)緣商業(yè)群體來(lái)自于全國(guó)15個(gè)核心育種場(chǎng)，品種包括純種杜洛克、長(zhǎng)白、大白、皮特蘭、斯格及部分長(zhǎng)大二元豬(表1)，共計(jì)113個(gè)家系，每個(gè)家系中患病個(gè)體的數(shù)目為1～2個(gè)不等。樣本采集標(biāo)準(zhǔn)與資源家系相同。

表1 遠(yuǎn)緣群體中豬臍疝患病個(gè)體的品種分布情況

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

采集0.5～1.0 g豬耳組織，按照標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法提取DNA，然后將其溶于TE緩沖液中。用Nanodrop 1000核酸蛋白分析儀(Thermo Scientific, USA)測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量，A260/A280的比值在1.8～2.0之間判定為合格。將濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的完整性，片段長(zhǎng)度大于10 kb視為合格。質(zhì)量合格的DNA樣品用于多態(tài)位點(diǎn)的搜尋及基因分型。

1.2.2 多態(tài)位點(diǎn)的搜尋及基因分型

1.2.2.1 運(yùn)用比較測(cè)序法搜尋 SNP位點(diǎn) 在 Ensembl(http:/www.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站搜尋獲得豬12個(gè)基因(表2)的文庫(kù)序列，對(duì)這些基因的部分外顯子和內(nèi)含子使用在線引物設(shè)計(jì)軟件(http: //frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3.cgi)設(shè)計(jì)引物(部分引物見(jiàn)表2)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR模板來(lái)自資源家系中患病個(gè)體與正常個(gè)體分別混合形成的兩個(gè)DNA池。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括：基因組DNA 20 ng，ddH2O 17.5 μL，25 mmol/L Mg2+1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶2.5 U(博彩生物科技有限公司，上海)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)于PTC-200熱循環(huán)儀(BIO-RAD，USA)上進(jìn)行。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，復(fù)性(部分引物復(fù)性溫度見(jiàn)表2) 30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，Germany)純化，委托深圳華大中生科技發(fā)展有限公司雙向測(cè)序。通過(guò)BLAST分析，驗(yàn)證其特異性，再用DNAStar軟件包的Seqman程序分析鑒別SNPs。

表2 利用SNaPshot技術(shù)檢測(cè)的38個(gè)SNP位點(diǎn)的突變類(lèi)型及所用引物

續(xù)表2

1.2.2.2 SNaPshot基因分型 通過(guò)比較分析，在12個(gè)候選基因中共檢測(cè)到 99個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。選取在正常池與患病池存在差異或位于外顯子上的 38個(gè)SNP位點(diǎn)，在資源家系中利用 SNaPshot技術(shù)[20,21]進(jìn)行基因分型。SNaPshot反應(yīng)前PCR擴(kuò)增所用引物與SNP搜尋引物(表2)相同，SNaPshot 技術(shù)流程依照 SNaPshot ? Multiplex 試劑盒(ABI，USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體過(guò)程包括PCR產(chǎn)物純化、 SNaPshot反應(yīng)、SNaPshot反應(yīng)產(chǎn)物純化和純化產(chǎn)物變性及上樣4個(gè)步驟。利用3130 xl遺傳分析儀(ABI，USA)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，經(jīng) Gene Mapper Software version 3.7 (ABI，USA)分析后得到基因型數(shù)據(jù)。

1.2.2.3 PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型ZFAND6基因中 g.2395 C＞T和 g.15060 A＞G 兩個(gè)位點(diǎn)用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型。過(guò)程如下：在3 μL PCR產(chǎn)物(引物見(jiàn)表3)中加入0.2 μL限制性?xún)?nèi)切酶(10 U/μL)、1.2 μL10×緩沖液和7.6 μL去離子水，于37℃溫育6 h或過(guò)夜。上述反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)3.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并記錄不同片段所代表的基因型結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

基于家系的傳遞不平衡檢驗(yàn)(TDT)是研究疾病性狀的重要方法，可有效避免復(fù)雜的群體分層效應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果偏差。本研究采樣來(lái)源廣泛、遺傳背景復(fù)雜，具有一定程度的群體分層效應(yīng)，因而選用plink v 1.07程序中的TDT[22]命令進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。其原理是：分析某個(gè)等位基因從雜合子父母?jìng)鬟f給患病子代的機(jī)率是否高于預(yù)期值(50%)，如果這個(gè)家系至少有一個(gè)親本是雜合子，則進(jìn)行經(jīng)典的TDT分析；如果雙親的基因型缺失，則進(jìn)行同胞TDT(Sib transmission disequilibrium test，S-TDT)檢驗(yàn)[23,24]。當(dāng)連鎖不平衡程度很高的情況下，標(biāo)記與致病基因緊密

表3 ZFAND6基因內(nèi)兩個(gè)SNPs的突變類(lèi)型及分型方法

連鎖時(shí)，它的檢測(cè)效率很高。計(jì)算公式如下：

其中n是SNP的數(shù)目，bi為傳遞的SNP數(shù)目，ci為未傳遞的SNP的數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP搜尋結(jié)果

通過(guò)比較分析，在 12個(gè)候選基因中共檢測(cè)到99個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。選擇在正常池與患病池存在差異或位于外顯子上的40個(gè)SNP位點(diǎn)(表4)作為候選SNP在資源家系中進(jìn)行基因分型，40個(gè)SNPs在易感區(qū)域內(nèi)的分布情況見(jiàn)圖1。

2.2 PCR-RFLP方法進(jìn)行基因分型結(jié)果

利用PCR-RFLP方法對(duì)ZFAND6基因中g(shù).2395 C＞T和g.15060 A＞G兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 基因型數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果

應(yīng)用PLINK v1.07[22]軟件分別對(duì)F2/F3資源家系臍疝群體的 40個(gè)多態(tài)位點(diǎn) (Sscrofa10.2版本 http: //www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)及在遠(yuǎn)緣三聯(lián)體核心家系群中需要驗(yàn)證的4個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)量控制。剔除個(gè)體基因型檢出率小于75%的個(gè)體；剔除SNP位點(diǎn)檢出率小于90%、哈迪溫伯格平衡卡方檢驗(yàn)P≤10-5和最小等位基因頻率小于0.05的SNP位點(diǎn)。結(jié)果表明，F(xiàn)2/F3資源家系臍疝群體中有157個(gè)個(gè)體通過(guò)檢驗(yàn)，質(zhì)控后剩余30個(gè)SNP標(biāo)記可用于后續(xù)研究。遠(yuǎn)緣群體中325個(gè)個(gè)體的4個(gè)SNP位點(diǎn)全部通過(guò)檢驗(yàn)，可用于后續(xù)TDT重復(fù)驗(yàn)證分析。

表4 12個(gè)位置候選基因中SNP搜尋結(jié)果匯總

2.4 資源家系臍疝群體多態(tài)位點(diǎn)與豬臍疝的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

2.4.1 白色杜洛克×二花臉資源家系臍疝群體的TDT分析

TDT分析結(jié)果顯示，白色杜洛克×二花臉F2/F3資源家系臍疝群體中12個(gè)位置候選基因內(nèi)的40個(gè)SNP位點(diǎn)有30個(gè)通過(guò)質(zhì)量控制并用于TDT分析，與臍疝關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的多態(tài)位點(diǎn)是位于SSC7上IL16基因內(nèi)的g.708C＞T位點(diǎn)(P＜0.05) (表5)。另外，SSC10上CDC73基因內(nèi)的 g.10664G＞A位點(diǎn)與臍疝的關(guān)聯(lián)性也達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

圖1 SSC7(A)和SSC10(B)上臍疝易感區(qū)域的基因及所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)分布圖A：利用微衛(wèi)星標(biāo)記在白色杜洛克×二花臉資源家系中采用NPL方法在SSC7上與臍疝連鎖分析檢測(cè)結(jié)果的折線圖。其中橫坐標(biāo)表示染色體上的位置，用cM表示；縱坐標(biāo)表示NPL值，下同。下方橫線為SWR1928標(biāo)記易感區(qū)域放大圖，橫線上黑色三角表示候選基因的物理位置位置，黑色菱形表示微衛(wèi)星的物理位置，用Mb表示，下同?；蛳路降暮诳騼?nèi)是位于候選基因內(nèi)所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)名稱(chēng)，其位置是從該基因起始密碼子ATG開(kāi)始算起的物理距離，以bp表示，下同。B：SSC10上與臍疝連鎖分析檢測(cè)結(jié)果的折線圖。下方橫線為SW830標(biāo)記易感區(qū)域的放大圖；基因下方的黑框內(nèi)是位于候選基因內(nèi)所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)名稱(chēng)。

圖2 ZFAND6基因兩個(gè)SNPs的PCR-RFLP判型結(jié)果A：g.2395C＞T位點(diǎn)酶切結(jié)果(兩個(gè)條帶為CC型，3個(gè)電泳條帶為CT型，1個(gè)條帶為T(mén)T型)；B：g.15060A＞G位點(diǎn)酶切結(jié)果(2個(gè)條帶為AA型，4個(gè)條帶為AG型，3個(gè)條帶為GG型)。

2.4.2 IL16基因和CDC73基因中SNP位點(diǎn)在遠(yuǎn)緣群體中與臍疝的TDT分析

IL16基因內(nèi) g.708C＞T位點(diǎn)和 CDC73基因內(nèi)g.10664G＞A位點(diǎn)在資源家系中與臍疝的發(fā)生呈顯著關(guān)聯(lián)，對(duì)該兩位點(diǎn)在遠(yuǎn)緣群體中進(jìn)行關(guān)聯(lián)重復(fù)驗(yàn)證，TDT分析表明IL16基因內(nèi) g.708C＞T位點(diǎn)在遠(yuǎn)緣群體中并沒(méi)有表現(xiàn)出與臍疝發(fā)病的關(guān)聯(lián)性，但CDC73基因中的 g.10664G＞A位點(diǎn)與臍疝發(fā)生呈顯著相關(guān)。鑒于這一結(jié)果，對(duì)CDC73基因中的另外兩個(gè)在資源家系臍疝群體中呈弱相關(guān)(P＜0.1)的位點(diǎn) g.10546A＞G和g.10811A＞G(表 6)在遠(yuǎn)緣商業(yè)豬群 325個(gè)個(gè)體中進(jìn)行基因分型及 TDT分析，結(jié)果表明：g.10546A＞G和g.10811A＞G位點(diǎn)與臍疝的發(fā)生呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)。

表5 12個(gè)位置候選基因內(nèi)30個(gè)SNP 位點(diǎn)與白色杜洛克×二花臉資源家系中臍疝的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

續(xù)表5

表6 IL16和CDC73基因中SNP位點(diǎn)在遠(yuǎn)緣群體中與臍疝的TDT分析結(jié)果

3 討 論

臍疝作為一種復(fù)雜的遺傳缺陷疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失且影響豬只福利。本研究通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期在白色杜洛克×二花臉F2資源家系臍疝群體中定位到的兩個(gè)影響臍疝發(fā)生的QTL區(qū)域[15]內(nèi)12個(gè)位置候選基因的研究發(fā)現(xiàn)：IL16基因中g(shù).708C＞T位點(diǎn)和CDC73基因中g(shù).10664G＞A位點(diǎn)與臍疝發(fā)生呈顯著關(guān)聯(lián)，且分別是突變型T和A傳遞給后代患臍疝的可能性更大(表5)。IL16是淋巴細(xì)胞趨化因子，其前體在胞質(zhì)內(nèi)由胱天蛋白酶3裂解成2個(gè)片段：N端片段和C端片段。N端片段包含2個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域和一個(gè)有利于轉(zhuǎn)移至核內(nèi)的核定位序列，該片段轉(zhuǎn)入核內(nèi)參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)(阻滯G0/G1轉(zhuǎn)化)[25]，高志濤等[26]證實(shí) IL16對(duì)人白血病細(xì)胞系 MT2 細(xì)胞增殖受阻且出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。胚胎發(fā)育早期，胚位于臍環(huán)部位的外胚層基板，處于外胚層與中胚層的連接過(guò)度區(qū)域，隨著胚胎的發(fā)育，外胚層出現(xiàn)細(xì)胞程序性凋亡、基底膜分解，中胚層細(xì)胞則正常增殖并在中胚層囊腔中沉積，最終在臍環(huán)處閉鎖形成腹壁[27]，臍環(huán)閉鎖失敗則可能導(dǎo)致臍疝的發(fā)生。推測(cè)IL16基因的突變可能引起外胚層細(xì)胞凋亡或中胚層細(xì)胞增殖受阻而導(dǎo)致臍部閉合缺陷，從而導(dǎo)致臍疝的發(fā)生。CDC73基因則編碼細(xì)胞分裂蛋白，亦是RNA聚合酶II復(fù)合物因子1(Paf1)的重要組成成分，CDC73基因通過(guò)Paf1來(lái)參與轉(zhuǎn)錄因子的激活、3'mRNA的加工剪切、補(bǔ)充和激活組蛋白及染色質(zhì)的正常延伸等與細(xì)胞循環(huán)分裂、蛋白轉(zhuǎn)錄合成、核酸代謝等過(guò)程[28]。Rather等[29]研究表明CDC73下調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡，上調(diào)抑制細(xì)胞增殖，且可通過(guò)PAF1C參與wnt通路，而wnt通路可調(diào)控上皮細(xì)胞-間葉細(xì)胞互作和表型轉(zhuǎn)化(EMT)[30]，EMT發(fā)生異常會(huì)導(dǎo)致腹壁閉合和發(fā)育異常，從而誘導(dǎo)臍疝的形成。

對(duì)這兩個(gè)基因中的關(guān)聯(lián) SNP在遠(yuǎn)緣群體中進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證研究，CDC73基因在兩個(gè)群體中均表現(xiàn)出與臍疝發(fā)生不同程度的關(guān)聯(lián)性，推測(cè)其可能在豬臍疝的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。而IL16基因中候選SNP并未得到驗(yàn)證，其原因可能是：作為一種復(fù)雜的遺傳缺陷疾病，臍疝具有復(fù)雜疾病所特有的致病因子多、遺傳異質(zhì)性強(qiáng)、遺傳和環(huán)境因素存在緊密互作等特點(diǎn)，微效多基因模式可能是其主要的發(fā)生機(jī)制[31]。微效多基因模式提示，臍疝易感或風(fēng)險(xiǎn)基因有可能在群體中的發(fā)生頻率都很低，每個(gè)基因作用微小，單獨(dú)不足以致病，且可能對(duì)于疾病既非充分也非必要，但它們之間存在相互作用，通過(guò)多個(gè)基因的劑量效應(yīng)，達(dá)到疾病發(fā)生的臨界點(diǎn)，從而共同決定臍疝的遺傳易感性。因此，IL16基因和CDC73基因內(nèi)的SNP位點(diǎn)與臍疝的關(guān)聯(lián)性?xún)H僅達(dá)到顯著水平，其可能只是眾多易感基因中的一小部分。同時(shí)，IL16基因并未在遠(yuǎn)緣群體中得到驗(yàn)證可能是群體異質(zhì)性造成的，即資源家系與遠(yuǎn)緣群體中的臍疝致病突變存在共性的同時(shí)也存在一定的特異性。

綜上所述，本研究在白色杜洛克×二花臉資源家系中鑒別到兩個(gè)臍疝易感基因IL16和CDC73中存在臍疝關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，經(jīng)在遠(yuǎn)緣群體中的進(jìn)一步TDT重復(fù)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CDC73基因極有可能是影響豬臍疝的候選易感基因。

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(責(zé)任編委: 李明洲)

Identification of susceptibility gene for pig umbilical hernia in different populations using transmission disequilibrium test

Ying Su1, Yi Long1, Guorong Ruan1,2, Lihua Wu1, Zhiyan Zhang1, Shijun Xiao1, Weiyun Deng1, Xianshan Lv1, Dou Hu1, Guozao Wu1, Huqun Shen1, Xinjun Liao1,3, Nengshui Ding1, Lusheng Huang1

1. Candidate of National Key Laboratory for Animal Biotechnology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang, 330045, China;
2. Fujian Vocational College of Agriculture, Fuzhou 350119, China;
3. College of Life Science of Jinggangshan University, Ji’an 343009, China

A genome-wide scan for pig umbilical hernia (UH) was performed in a White Duroc × Erhualian resource population reported by our previously study, which detected two susceptibility microsatellite markers (SWR1928 on SSC7 and SW830 on SSC10) significantly affecting pig UH. Herein, fine mapping studies and identification of susceptibility genes for UH were performed in two different populations. A total of 40 SNPs in 12 positional candidate genes located on the two significant segments were genotyped in the F2/F3resource population. Quality control of the genotype data and transmission disequilibrium test (TDT) were conducted using Plink v1.07 software. The results showed that g.708G＞A in IL16 (interleukin 16) gene and g.10664G＞A in CDC73 (cell division cycle 73) gene were significantly associated with pig UH. These two prominent SNPs and another two weakly associated SNPs g.10546A＞G and g.10811A＞G in CDC73 were also undergone the replication TDT test in the outbred commercial populations. All SNPs in the CDC73 gene were confirmed to be significantly associated with pig UH (P＜0.05), including g. 10546A＞G and g.10811A＞G with extreme significant level (P＜0.01). Based on these results, CDC73 should be a susceptibility gene for pig UH according to its biological functions and the molecular pathogenesis of UH.

pig; umbilical hernia; positional and functional candidate gene; transmission disequilibrium test; CDC73

2014-03-16;

2014-08-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31272422)，教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：教技函[2012]80)，國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(編號(hào)：2011BAD28B01)和江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(編號(hào)：JXARS-03)資助。

宿英，碩士，專(zhuān)業(yè)方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：xy19880910@yeah.net；龍毅，博士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：longyilongyily@163.com宿英和龍毅同為第一作者。

丁能水，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物育種新技術(shù)研究。E-mail: dingyd2005@hotmail.com

致 謝: 本文臍疝樣本的采集得到江西正邦集團(tuán)轄屬種豬場(chǎng)、廣西農(nóng)墾永新畜牧有限公司良圻原種豬場(chǎng)、廣西楊翔農(nóng)牧有限公司、廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司、河南正陽(yáng)諸美原種豬場(chǎng)、海南羅牛山種豬育種有限公司、安徽長(zhǎng)風(fēng)農(nóng)牧科技有限公司、福建省永誠(chéng)華多種豬有限公司、山東省日照原種豬場(chǎng)等全國(guó)15個(gè)原種豬場(chǎng)的大力支持，在此一并感謝！

10.3724/SP.J.1005.2014.0995

時(shí)間: 2014-9-2 10:34:34

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140911.1049.004.html