冉茂良，陳斌，尹杰，楊岸奇，李智，蔣明

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；

2. 畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙 410128；

3. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125；

4. 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

豬microRNA組學(xué)研究進(jìn)展

冉茂良1,2，陳斌1,2，尹杰3,4，楊岸奇1,2，李智1,2，蔣明1,2

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；

2. 畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙 410128；

3. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125；

4. 中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

MicroRNA(miRNA)是一類長約22 nt的非編碼小RNA，廣泛存在于各種生物中，調(diào)節(jié)生物體生長、發(fā)育和凋亡等過程。研究表明，miRNA在豬肌肉、脂肪、生殖系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此外，高通量的新一代測序技術(shù)在豬miRNA的挖掘和差異表達(dá)研究中發(fā)揮著巨大的作用。文章綜述了高通量的新一代測序技術(shù)在挖掘豬miRNA中的應(yīng)用以及一些miRNA在豬脂肪代謝、肌肉發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟和B、T淋巴細(xì)胞發(fā)育中的調(diào)控作用，旨在為豬miRNA的研究提供參考，為利用miRNA調(diào)控和改善豬肉品質(zhì)、生長性能、繁殖性能以及免疫機(jī)能提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

豬；microRNA；脂肪代謝；肌肉發(fā)育；卵母細(xì)胞成熟；免疫

Keywords:porcine; miRNA; fat metabolism; muscle development; oocyte maturation; immunity

豬不僅為人類提供日常肉質(zhì)品還可以作為模式動物研究人類疾病[1]，在畜牧業(yè)和科學(xué)研究中占據(jù)著十分重要的地位，因此關(guān)于豬的基因研究一直是科研領(lǐng)域的熱點(diǎn)。自 1993年從線蟲中首次發(fā)現(xiàn)miRNA(Lin-4)[2]且其在線蟲發(fā)育過程中的時間控制作用同時也得到證實以來，動植物基因的表達(dá)調(diào)控研究中涌現(xiàn)出了一個嶄新的領(lǐng)域——miRNA調(diào)控。miRNA 調(diào)控主要是通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶mRNA結(jié)合后形成雙鏈 RNA，從而誘導(dǎo)靶 mRNA降解或抑制其翻譯過程[3,4]，研究表明 miRNA在細(xì)胞增殖、分化和凋亡，生物的生長、發(fā)育以及疾病的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5,6]。但是，截止2014年4月15日，miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫(http: //www.mirbase.org/)收錄豬miRNAs前體280條，成熟體326條；而人miRNAs前體1872條，成熟體2578條；小鼠miRNAs前體1186條，成熟體1908條；大鼠miRNAs前體449條，成熟體728條，相比于同等基因組大小的人、小鼠和大鼠等哺乳動物，豬miRNA的研究還需亟待加強(qiáng)。目前關(guān)于豬miRNA的研究方法主要集中于微陣列芯片、高通量測序、實時熒光定量PCR等技術(shù)以提高檢測通量、靈敏度和特異性[7]；其研究的主要內(nèi)容多集中于miRNA對肌肉、脂肪和生殖系統(tǒng)生長發(fā)育以及疾病的發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控作用。因此，本文對豬miRNA的研究進(jìn)展，尤其是豬 miRNA的挖掘、部分重要 miRNAs對豬脂肪和肌肉發(fā)育、繁殖生理及免疫調(diào)控進(jìn)行了綜述，以期為豬miRNA的研究提供參考。

1 豬miRNA挖掘的高通量技術(shù)

挖掘和鑒定豬miRNA是研究豬miRNA的前提，隨著實驗方法和技術(shù)的不斷改進(jìn)，高通量技術(shù)在挖掘鑒定 miRNA中表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，推動了豬miRNA的研究。目前，高通量技術(shù)主要包括新一代高通量測序技術(shù)、miRNA芯片技術(shù)和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，集中于挖掘和鑒定豬已知的或新的miRNA，以及不同生理狀態(tài)、品種或品系、發(fā)育階段間差異表達(dá)的miRNA種類和豐度(表1)，從而證實這些差異表達(dá)的miRNA在相應(yīng)的生理狀態(tài)、發(fā)育階段以及不同的品種或品系之間潛在的生物學(xué)功能，但這些被挖掘和鑒定出來的大量miRNAs在豬生長發(fā)育和生理活動中的生物學(xué)功能、miRNAs互相之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及 miRNA的表達(dá)調(diào)控仍需進(jìn)一步實驗驗證。

高通量的新一代測序技術(shù)，例如Illumina 公司開發(fā)的Illumina/Solexa Genome Analyzer、Roche公司開發(fā)的 Roche/454 FLX以及 ABI公司開發(fā)的SOLIDTMSystem等，在很大程度上加快了全基因組的從頭測序和重測序[8]。自新一代高通量測序技術(shù)出現(xiàn)以來，利用其挖掘豬miRNA的研究開始涌現(xiàn)，推動了豬miRNA的研究進(jìn)展(表1)。本文著重介紹幾項在豬 miRNA挖掘鑒定中具有推重作用的研究供參考。Li等[9]采用Solexa測序技術(shù)從7、240日齡的榮昌豬背部皮下脂肪中檢測出的miRNAs屬于32個簇，包括 miR-143、miR-103、miR-148和 Let-7等簇，其中miR-378和miR-143分別在仔豬和成年豬脂肪組織中表達(dá)量最高，且 miR-143、miR-378、miR-103、miR-148a、miR-21、miR-10b、miR-30a-5p和 miR-199a-3p均高表達(dá)于兩個發(fā)育階段的背部皮下脂肪組織。Bai等[10]采用SOLIDTMSystem從閹割和非閹割的出生后 161日齡的公豬背部皮下脂肪組織中檢測出177個差異表達(dá)的miRNAs，其中45個上調(diào)、132個下調(diào)，miR-143、miR-145、miR-199b、miR-103和miR-10a等高表達(dá)于閹割組，miR-320a、miR-21、miR-191和miR-143等高表達(dá)于非閹割組，表明 miRNA在不同生理狀態(tài)下的表達(dá)不同。Hou等[11]采用Solexa測序技術(shù)從通城豬18個時間點(diǎn)(胚胎期：33、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105 d；出生后：0、10、100、180 d)背最長肌混合 RNA文庫中檢測出 275個miRNAs，其中miR-1、miR-378和miR-206表達(dá)量最高，且miR-378在胚胎期第33 d低表達(dá)、第65～90 d逐漸增加，出生時達(dá)最高水平，隨后維持在相對穩(wěn)定的水平，這為全面揭示豬骨骼肌中 miRNA的表達(dá)起到了重要作用。Timoneda等[12]利用Roche/454 FLX高通量測序技術(shù)從歐洲原種豬(伊比利亞品種、歐洲野豬)、歐洲商品豬(長白豬、大白豬、皮特蘭豬)、亞洲血統(tǒng)品種(梅山豬、越南豬(Vietnamese))腎組織中檢測出42個miRNAs表達(dá)于每個品種，其中以miR-200b-3p、miR-125b和miR-23b的表達(dá)量最高，125個miRNAs在不同品種間呈差異表達(dá)，由于樣品來源于血緣關(guān)系較遠(yuǎn)的品種，進(jìn)一步說明不同品種的同一組織中miRNA的表達(dá)存在很大差異。

表1 高通量技術(shù)挖掘豬miRNA的部分結(jié)果

miRNA芯片技術(shù)可以在短時間內(nèi)同時鑒定所有已知miRNA的表達(dá)譜，速度快、信息量大，但其僅限于檢測已知的 miRNA。目前關(guān)于利用 miRNA芯片技術(shù)鑒定豬miRNA表達(dá)譜的研究也較多，主要研究對象有肌肉、脂肪和繁殖生理等。在肌肉發(fā)育方面，Chen等[14]從豬65和90胚齡的骨骼肌中檢測出有強(qiáng)烈信號的miRNAs包括miR-206、miR-133a/b、miR-127、miR-106a、miR-27a和miR-1等，它們均是調(diào)控肌肉發(fā)育的典型 miRNAs，qRT-PCR證實miR-24和miR424在90胚齡的骨骼肌中顯著下調(diào)，而 miR-133a則顯著上調(diào)。相比之下，Zhou等[15]從豬90胚齡和120日齡的骨骼肌(背最長肌)中檢測出的miRNAs稍多，其中miR-199b、let-7在90胚齡的骨骼肌中高表達(dá)，miR-1a、miR-133a在120日齡的骨骼肌中高表達(dá)，miR-1826、miR-26a則在兩個樣品中均高表達(dá)。Zhao等[16]從豬 33、65、90胚齡和成年的骨骼肌(背最長肌)中檢測出20 201個基因(1947個差異表達(dá))和779個miRNAs(214個差異表達(dá))。在繁殖生理方面，Luo等[23]在60和180日齡豬睪丸中檢測出129個差異表達(dá)miRNAs，51個在成熟睪丸組織中顯著上調(diào)，78個顯著下調(diào)，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們存在15 919個靶位點(diǎn)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜。Su等[24]在大白豬妊娠期15和26 d的子宮內(nèi)膜中檢測出包括miR-181簇在內(nèi)的51個差異表達(dá)的 miRNAs，生物信息學(xué)分析顯示它們在胚胎植入和著床過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，后續(xù)實驗也證實miR-181a/c可能通過SPP1、ITGB3和ESR1基因調(diào)控豬胚胎植入和著床過程。而在脂肪和其他組織發(fā)育和生理方面，Li等[18]從大白豬和藍(lán)塘豬脂肪組織中鑒定出48個差異表達(dá)的miRNAs，21個在藍(lán)塘豬脂肪組織中顯著上調(diào)，33個高表達(dá)于長白豬脂肪組織，從而證實不同品種的同一組織miRNA的表達(dá)有所不同。Podolska等[19]通過對丹麥本地豬 50、100胚齡和 3月齡的大腦皮層和小腦組織中鑒定出的157個差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，顯示它們在豬腦部發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)發(fā)育和生理過程的作用?；趍iRNA芯片技術(shù)通量高、速度快的特點(diǎn)，利用其鑒定豬各組織差異表達(dá)的miRNA，能快速、準(zhǔn)確地篩選出差異表達(dá)的miRNA，有利于推動miRNA的功能研究。

熒光定量 PCR(qRT-PCR)技術(shù)是一種新型的核酸定量技術(shù)，與常規(guī)PCR相比，qRT-PCR具有檢測靈敏、精確、特異性強(qiáng)、無污染、快速等特點(diǎn)。在新一代高通量測序技術(shù)和 miRNA芯片技術(shù)挖掘和鑒定miRNA過程中，qRT-PCR發(fā)揮著對這兩種技術(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗證的作用。如表 1所示，qRT-PCR驗證是每一項利用高通量技術(shù)挖掘和鑒定 miRNA的必要步驟，但目前利用qRT-PCR驗證量均少于30個，驗證量相比于高通量技術(shù)每次檢測出的大量miRNAs則顯得較少。qRT-PCR也可以單獨(dú)作為一種技術(shù)研究miRNA表達(dá)，目前關(guān)于利用qRT-PCR技術(shù)構(gòu)建特定 miRNA在不同豬種或不同組織中表達(dá)譜的研究報道較多。例如：qRT-PCR表達(dá)分析顯示不同豬種的不同組織中 10個 miRNAs(Let-7a、miR-103、miR-17-3p、miR-25、miR-93、miR-106a、miR-191、miR-16、miR-26a和miR-17-5p)均具有較好的穩(wěn)定性，可以作為參照miRNA[30]；qRT-PCR證實了Let-7a、-7d、-7e和miR-22高表達(dá)于豬形態(tài)異常精子，而 Let-7a、-7e高表達(dá)于低活力精子[31]。qRT-PCR技術(shù)在豬miRNA研究中的用途廣泛，且與其他技術(shù)聯(lián)合使用能進(jìn)一步提高實驗結(jié)果的可靠性。

隨著測序和基因芯片費(fèi)用逐漸降低以及對實驗結(jié)果可靠性的要求不斷提高，將新一代高通量測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于挖掘和鑒定豬 miRNA中的研究報道也逐漸增多。Li等[18]聯(lián)合使用這3種技術(shù)從長白豬和藍(lán)塘豬骨骼肌和脂肪組織中發(fā)掘鑒定184個已知的miRNA(Solexa測序鑒定113個，基因芯片鑒定171個)、521個新的 miRNAs，并用 qRT-PCR驗證了從 181個已知miRNAs中隨機(jī)抽取的20個，最終分析表明在豬脂肪和肌肉發(fā)育中存在miRNAs的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。此外，本實驗室馬海明教授課題組聯(lián)合使用這3 種技術(shù)挖掘和鑒定了某兩個地方豬種骨骼肌中 miRNA的表達(dá)，并成功構(gòu)建差異表達(dá)譜(未發(fā)表)。因此，在挖掘和鑒定豬miRNA過程中，將不同高通量技術(shù)根據(jù)實驗需求進(jìn)行聯(lián)合使用有利于提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 miRNA與豬脂肪代謝

脂肪不僅是動物機(jī)體能量儲存的一種形式，而且還參與調(diào)節(jié)包括食欲和能量消耗等多個機(jī)體功能。研究表明，脂肪還調(diào)控著多個復(fù)雜的生理過程，例如繁殖、炎癥和免疫反應(yīng)[32]。研究豬的脂肪代謝不僅有利于提高豬的胴體性能，還有助于推動人類肥胖和代謝性疾病的研究。研究表明，miRNA參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖和分化，因此研究已鑒定的miRNA在脂肪組織中的調(diào)控作用將顯著提高人們對脂肪組織生長和發(fā)育的認(rèn)識。如表 1所示，豬脂肪組織表達(dá)的miRNA在不同品種、發(fā)育時期和生理狀態(tài)下主要表現(xiàn)為數(shù)量和種類上的差異，由此表明這些miRNAs在脂肪的生理過程中具有重要的作用，而差異表達(dá)的miRNAs則在某一特定的狀態(tài)下對脂肪組織的生理過程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

脂肪細(xì)胞的分化起始于多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，經(jīng)歷脂肪母細(xì)胞、前體脂肪細(xì)胞和不成熟脂肪細(xì)胞，最后止于成熟脂肪細(xì)胞。在脂肪細(xì)胞的分化過程中，miRNA發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但它們的調(diào)控效應(yīng)和靶基因則存在很大的差異。如表2所示，miR-103、miR-106b、miR-93、miR-26b、miR-143、miR-21和 miR-146b等促進(jìn)脂肪細(xì)胞或前體脂肪細(xì)胞分化，而miR-191、miR-135a、miR-224-5p、miR-24、miR-27、miR-33b、miR-125a、miR-130和miR-133a等則在脂肪細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮抑制作用。就前體脂肪細(xì)胞而言，miR-103、miR-143和 miR-146b等分別通過靶向RAI14、PTN和KLF7基因的表達(dá)實現(xiàn)促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化，而miR-135a、miR-125a和miR-133a等則通過靶向APC、ERRα和Prdm16基因抑制其分化。在miRNA調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的過程中，各miRNA可通過靶向相同的基因而實現(xiàn)拮抗或協(xié)同作用，進(jìn)而形成對脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；miR-21可通過抑制 AP-1的表達(dá)顯著地促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[37]，而miR-24則可通過上調(diào)AP-1的表達(dá)而顯著抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的分化和成熟[42]；miR-191、miR-27、miR-33b和miR-130等均可通過抑制PPARγ的表達(dá)抑制脂肪細(xì)胞或前體脂肪細(xì)胞分化。miRNA也可以通過靶向多個基因以調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，miR-27在前體棕色脂肪細(xì)胞分化過程中通過負(fù)向調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本中的重要組成部分——Prdm16、Pparα、Creb和部分Pgc1β而抑制前體棕色脂肪細(xì)胞分化[43]；在豬前體細(xì)胞中過表達(dá)miR-191可顯著增加其轉(zhuǎn)錄本，且降低C/EBPβ、PPARγ以及Ap2基因的mRNA水平，抑制豬前體脂肪細(xì)胞分化，C/EBPβ的蛋白水平在48 h后降低55%，雙熒光素酶報告基因檢測證實miRNA-191可直接作用于C/EBPβ mRNA 3′-UTR，從而證實miR-191可能通過抑制脂肪細(xì)胞分化早期標(biāo)志基因C/EBPβ的表達(dá)而抑制豬前體細(xì)胞分化[39]；miR-33b通過抑制脂肪合成基因(從EBF1到C/EBPα和 PPARγ之間的級聯(lián))的表達(dá)而抑制豬皮下前體脂肪細(xì)胞的分化和發(fā)育[44]。

表2 對豬脂肪細(xì)胞分化具有調(diào)控作用的miRNA

此外，miRNA在脂肪細(xì)胞增殖、脂滴積聚以及脂肪形成中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在豬脂肪細(xì)胞中過表達(dá) miR-27a能夠顯著加速脂肪水解以釋放出更多的甘油和游離脂肪酸，而miR-143的過表達(dá)則能在脂肪細(xì)胞中積累更多的甘油三酯以促進(jìn)脂肪形成[48]；miR-181a靶向TNF-α mRNA 3′-UTR，并且miR-181a能夠抑制Hela細(xì)胞中TNF-α蛋白水平，而在豬前體脂肪細(xì)胞中過表達(dá) miR-181a以及抑制TNF-α基因的表達(dá)可明顯增加豬前體脂肪細(xì)胞中脂滴積聚，從而證實 miR-181a可通過作用于 TNF-α基因以調(diào)節(jié)豬脂肪形成[49]。miR-145在豬去分化脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量增加，且過表達(dá)miR-145可通過調(diào)節(jié)IRS1基因的mRNA水平以抑制脂肪細(xì)胞的兩個標(biāo)志基因C/EBPα和PPARγ2，進(jìn)而抑制甘油三酯積聚和脂肪形成[50]。

miR-15a通過微調(diào)DLK1(Delta-like1homologue)基因促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的發(fā)育而抑制其增殖，而抑制miR-15a的表達(dá)則促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖而抑制其發(fā)育，證實miR-15a和DLK1基因在前脂肪細(xì)胞的生長信號通路中發(fā)揮重要作用[51]。

3 miRNA與豬肌肉發(fā)育

miR-1和 miR-133主要在骨骼肌和心肌特異性表達(dá)，并調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖和分化[52]，二者均位于同一條染色體上，在發(fā)育過程中以組織特異性方式共同轉(zhuǎn)錄，但是miR-1和miR-133的表達(dá)水平和調(diào)節(jié)功能均存在著顯著的差異。研究證實miR-1在成肌細(xì)胞發(fā)育的整個階段均呈中度表達(dá)，在成熟肌細(xì)胞中表達(dá)量最高，而miR-133僅在成熟肌細(xì)胞中呈中度表達(dá)[53]；miR-1通過與一種肌肉基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄抑制因子(HDAC4)結(jié)合，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化為成熟的肌肉細(xì)胞而抑制其增殖，但miR-133則通過抑制血清應(yīng)答因子加速成肌細(xì)胞的增殖但抑制其分化[54]；在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞中，miR-1和miR-133對細(xì)胞凋亡的調(diào)控截然相反，miR-1通過降低 HSP60和 HSP70蛋白的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而miR-133則通過抑制caspase-9基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和蛋白表達(dá)水平抑制細(xì)胞凋亡[52]。以 miR-1為中心的mTOR-miR-1-HDAC4-follostatin通路對骨骼肌再生和成肌細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞融合具有重要的調(diào)節(jié)作用，即mTOR通過調(diào)控MyoD蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)miR-1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，miR-1抑制HDAC4的表達(dá)而導(dǎo)致卵泡抑素生成并與心肌細(xì)胞融合[55]。此外，miR-1在血管平滑肌細(xì)胞的分化過程中也具有重要作用，其通過KLF4的表達(dá)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的分化[56]。在豬體上的研究也表明，miR-1對骨骼肌的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，miR-1負(fù)向調(diào)節(jié) CNN3基因mRNA的表達(dá)，CNN3基因的SNPs與仔豬初生重和21日齡斷奶重顯著相關(guān)，從而證實miR-1可通過靶向 CNN3基因而調(diào)節(jié)豬骨骼肌的發(fā)育[57]；miR-1 SNPs與豬Ⅰ型和Ⅱa型肌纖維數(shù)量和分布顯著相關(guān)，改變miR-1的表達(dá)水平可顯著改變豬肌纖維成分，從而證實miR-1可能靶向豬肌纖維成分相關(guān)的一個候選基因而調(diào)控豬肌纖維的發(fā)育[58]。miR-133在肌肉發(fā)育過程中主要發(fā)揮抑制肌肉細(xì)胞分化而促進(jìn)其增殖的作用，miR-133a和 miR-133b可在轉(zhuǎn)錄水平抑制參與ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的FGFR1和PP2AC基因表達(dá)和ERK1/2的磷酸化，且FGFR1和PP2AC可以抑制C2C12成肌細(xì)胞分化而促進(jìn)其增殖，表明miR-133a和miR-133b分別通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路中的FGFR1和PP2AC基因促進(jìn)成肌細(xì)胞分化而抑制其增殖[59]。

miR-29和miR-206在肌肉發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)控作用。在骨骼肌的發(fā)育過程中，miR-29具有重要的調(diào)控作用，miR-29可通過下調(diào) Akt3(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一)的轉(zhuǎn)錄水平以抑制骨骼肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)其分化[60]；miR-29還可以通過靶向YY1而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化[61]。miR-29調(diào)節(jié)骨骼肌分化的作用也受到其他一些細(xì)胞因子或信號通路的調(diào)節(jié)，如TGF-β、Rybp和NF-KappaB-YY1等。在成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞過程中，miR-29的促分化作用受到 TGF-β的負(fù)向調(diào)節(jié)[62]，TGF-β-Smad3信號通過抑制MyoD的結(jié)合作用和增強(qiáng)YY1的作用而抑制miR-29的促成肌細(xì)胞分化作用[63]。而miR-29又可以通過抑制TGF-β-Smad3信號介導(dǎo)的HDAC4表達(dá)上調(diào)效應(yīng)而削弱TGF-β對成肌分化的抑制作用[64]，從而形成一個調(diào)節(jié)成肌分化的反饋網(wǎng)絡(luò)。Rybp(Ring1 and YY1-binding protein)作為骨骼肌分化和再生的反向調(diào)節(jié)因子，可以與YY1共同作用于miR-29，使其沉默，進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)骨骼肌生成[65]。在成肌細(xì)胞中，NF-KappaB通過YY1抑制 miR-29的表達(dá)，但是在肌肉生成過程中下調(diào)NF-KappaB和YY1的表達(dá)則可以消除這種抑制作用，進(jìn)而使得 miR-29通過靶向其本身的抑制因子 YY1而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化[61]。miR-206高表達(dá)于新形成的骨骼肌纖維，具有促進(jìn)骨骼肌纖維再生和成熟的作用[66]；此外，還具有促進(jìn)骨骼肌的分化，在骨骼肌發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。miR-206通過靶向多個基因調(diào)控骨骼肌發(fā)育，如Id1-3、MyoR、Pax7、BDNF、Notch-3、Hmyb3、RUNX1、ZNF238和Cx43等，除RUNX1和ZNF238以外，miR-206均是通過抑制這些靶基因的表達(dá)而促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化、發(fā)育和再生而抑制其增殖。同樣，miR-206調(diào)控骨骼肌發(fā)育的作用也受到其他一些因子的調(diào)節(jié)，在成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為骨骼肌細(xì)胞過程中，MyoD通過直接激活miR-206的表達(dá)而抑制Fstl1和Utm的表達(dá)，從而證實miR-206的調(diào)控作用受到MyoD的調(diào)節(jié)[67]。Notch3本身即為抑制骨骼肌分化的調(diào)控基因，研究表明Mef2c可促進(jìn)miR-206的表達(dá)而下調(diào)或完全抑制Notch3的表達(dá)以促進(jìn)骨骼細(xì)胞分化[68]。此外，miR-208、miR-486、miR-499、miR-23a、miR-214和miR-155等在肌肉組織的發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)控作用，但相關(guān)研究較少。miR-214表達(dá)于成肌細(xì)胞和肌管，在成肌細(xì)胞分化時被顯著上調(diào)，抑制miR-214可通過顯著下調(diào)肌細(xì)胞生成素和肌球蛋白的表達(dá)而抑制成肌細(xì)胞分化，此外還可以抑制成肌細(xì)胞增殖[69]。雙熒光素酶報告和 RT-PCR證實miR-155可調(diào)節(jié)OLFML3基因的mRNA表達(dá)水平，而OLFML3基因能夠影響胚胎期骨骼肌的發(fā)育，從而證實miR-155可通過靶向OLFML3基因而調(diào)節(jié)豬胚胎期骨骼肌的發(fā)育[70]。

4 miRNA與豬卵母細(xì)胞成熟

卵母細(xì)胞作為卵原細(xì)胞經(jīng)歷增殖分化、DNA復(fù)制、兩次減數(shù)分裂后的產(chǎn)物，在卵細(xì)胞發(fā)育成熟過程中扮演著重要的中間體角色。因此，卵母細(xì)胞的生長、成熟和發(fā)育能力直接影響著卵細(xì)胞的成熟，進(jìn)而影響雌性哺乳動物的產(chǎn)仔性狀。目前，已有很多研究表明miRNA能夠參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。Tesfaye等[71]研究證實在成熟和未成熟的卵母細(xì)胞分別有28和31種miRNA表達(dá)，其中有7個(miR-496、miR-292-3p、miR-99a、miR-410、miR-145 和 miR-515-5p)和2個(miR-512-5p、miR-214)差異表達(dá)于成熟和未成熟的卵母細(xì)胞。Wright等[72,73]證實，與GV(Germinal vesicle)期的卵母細(xì)胞相比，miR-21在MII(Second meiotic metaphase)期的表達(dá)被顯著提高，而在GV期到MII期，Western blot證實PDCD4蛋白則顯著降低，從而證實 miR-21的表達(dá)上調(diào)與PDCD4基因的轉(zhuǎn)錄后水平之間存在非常密切的關(guān)系。此外，當(dāng)抑制miR-21的表達(dá)則會顯著降低卵母細(xì)胞的成熟率，為了解miRNA與卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的關(guān)系提供了直接證據(jù)。研究表明，顆粒細(xì)胞對卵母細(xì)胞具有營養(yǎng)作用與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，這對卵母細(xì)胞的生長、成熟和發(fā)育能力具有重要的作用，因此，miRNA對顆粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用可間接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長、成熟和發(fā)育能力。Lin等[74]在豬顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物和寡核苷酸(對照組)72 h后，轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物后顆粒細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)染寡核苷酸的顆粒細(xì)胞正常生長，證明miR-26b可促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，而Real-time PCR和雙熒光素酶報告顯示miR-26b發(fā)揮功能是通過靶向ATM基因mRNA的5555位點(diǎn)以抑制ATM基因的表達(dá)，而ATM基因在DNA修復(fù)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，證實miR-26b可通過靶向 ATM基因而抑制卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。Yan等[75]通過Real-time PCR、Western blot和雙熒光素酶報告證實 miR-145通過靶向 ACVRIB基因mRNA 3′-UTR而抑制ACVRIB基因mRNA和蛋白表達(dá)水平，并激活誘導(dǎo)Smad2的磷酸化，從而抑制顆粒細(xì)胞增殖。Zhang等[76]證實在小鼠顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-181a可通過靶向ACVR2a基因的3′-UTR而抑制其表達(dá)，從而下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D2和增殖細(xì)胞細(xì)胞核抗原表達(dá)，最終抑制細(xì)胞增殖，而過表達(dá)ACVR2a基因則可削弱miR-181a對顆粒細(xì)胞增殖的這種抑制作用。Yin等[77]證實 miR-383主要表達(dá)于卵泡中的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，過表達(dá)miR-383可通過靶向RBMS1基因(Single stranded interacting protein 1)的mRNA而促進(jìn)顆粒細(xì)胞釋放雌二醇，而miR-383在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)和功能受到 SF-1(steroidogenic factor-1)的調(diào)節(jié)。Xu等[78]也證實miR-378時序性表達(dá)于豬顆粒細(xì)胞，且通過靶向芳香化酶 mRNA的 3′-UTR的兩個位點(diǎn)以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞釋放雌二醇。盡管一些關(guān)于miRNA在卵母細(xì)胞生長、發(fā)育中的功能研究是以小鼠為模型，但小鼠作為研究哺乳動物生理和生殖的模式生物，對研究miRNA在豬卵細(xì)胞中的功能也有很好的參考作用。

5 miRNA與B、T免疫細(xì)胞發(fā)育

miR-155、miR-17-92、miR-150、miR-28、miR-34a和miR-21等在B細(xì)胞的發(fā)育過程中均具有重要的調(diào)控作用。miR-155是目前發(fā)現(xiàn)的靶基因最多的miRNA之一，可以作用于細(xì)胞因子、蛋白受體、轉(zhuǎn)錄因子和酶類等，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-155通過抑制 GAB1(GRB2-associated binding protein 1)和FOXP1(Forkhead box P1)影響慢性淋巴細(xì)胞性白血病的B細(xì)胞受體信號[79]，也可以通過抑制SHIP1基因的表達(dá)促進(jìn)依賴TNFα的B細(xì)胞淋巴瘤的生長[80]。此外，c-MAF、PU1、AID和SHIP等也是miR-155的靶基因，從而在B細(xì)胞的成熟和產(chǎn)生高親和力抗體中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-17-92包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a，具有維持免疫細(xì)胞正常發(fā)育的作用[81]。Mu等[82]利用基因敲除證實miR-17-92簇、尤其是簇內(nèi)的miR-19a和miR-19b在原癌基因誘導(dǎo)的B細(xì)胞淋巴瘤中具有抑制凋亡的作用；同時結(jié)合基因表達(dá)譜、體外篩選和靶標(biāo)預(yù)測的結(jié)果證實 miR-19a和miR-19b在維持細(xì)胞活性中具有重要作用。miR-150作為B細(xì)胞發(fā)育的負(fù)向調(diào)控因子，主要表達(dá)與成熟的淋巴細(xì)胞，促使 B細(xì)胞滯留與 pro-B階段[83]，miR-150通過劑量依賴的方式調(diào)控 c-Myb(轉(zhuǎn)錄因子，在多個步驟控制淋巴細(xì)胞的發(fā)育)在體內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞的發(fā)育和應(yīng)答能力[84]。

在T細(xì)胞的發(fā)育和活性維持過程中同樣也受到miRNA的調(diào)控，如 miR-155、miR-223、miR-10a、miR-34a、miR-181a和miR-182等。miR-155直接作用于 IFN-gRα 3′非翻譯區(qū)而抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CD+ T細(xì)胞中Th1的分化以維持輔助性T細(xì)胞分化的平衡[85]；miR-155也可以通過促進(jìn)炎癥T細(xì)胞的發(fā)育而促進(jìn)動物機(jī)體的自身免疫性炎癥[86]；此外，miR-155在維持 T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和分化的平衡還可以通過靶向 c-MAF和 SOCS1等實現(xiàn)。miR-34a抑制DGKζ(具有抑制甘油二酯與T細(xì)胞受體結(jié)合的作用)的表達(dá)而促進(jìn) T細(xì)胞活性[87]。Li等[88]研究表明，免疫細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)與T細(xì)胞的敏感性呈較強(qiáng)的正相關(guān)，從而證實在 T細(xì)胞發(fā)育過程中miR-181a是一種內(nèi)在的抗原敏感性“變阻器”；但miR-181a通過抑制CD69和T細(xì)胞受體的表達(dá)使胸腺內(nèi)成熟T細(xì)胞輸出量和陽性選擇后存活的T細(xì)胞數(shù)量減少，達(dá)到增強(qiáng)T細(xì)胞活性而抑制T細(xì)胞數(shù)量的作用[89]。此外，miR-350、miR-92、miR-669c、miR-297、miR-15b、miR-150、miR-24和 miR-27a也參與T細(xì)胞的發(fā)育和分化過程，但相關(guān)研究較少，有待進(jìn)一步深入研究。

6 結(jié) 語

在豬miRNA后續(xù)的相關(guān)研究中，應(yīng)當(dāng)充分利用新一代的高通量測序和芯片技術(shù)挖掘更多的豬miRNA，此外豬 miRNA的表達(dá)分析和功能驗證也有待進(jìn)一步研究。對miRNA的表達(dá)譜分析應(yīng)著眼于不同生理狀態(tài)以及不同發(fā)育階段特異性表達(dá)的miRNA，探討豬 miRNA與生長性能、豬肉品質(zhì)、繁殖性能和健康狀況等的相關(guān)性，從而篩選出miRNA的分子標(biāo)記。而對于豬miRNA的功能驗證，則應(yīng)深入研究特異性表達(dá)的miRNA的作用機(jī)理，以及環(huán)境因素、營養(yǎng)水平等對這些miRNA的調(diào)控機(jī)制。此外，關(guān)于怎樣利用miRNA來改善豬生長性能、豬肉品質(zhì)、繁殖性能和健康狀況也非常值得研究。

目前，通過細(xì)胞培養(yǎng)驗證miRNA的功能，利用轉(zhuǎn)染、人工芯片抑制、基因敲除以及雙熒光素酶報告檢測等技術(shù)研究 miRNA在生理過程中的靶基因及其調(diào)控作用，此此基礎(chǔ)上，在機(jī)體水平對miRNA進(jìn)行研究，加強(qiáng)探討豬miRNA抑制和過表達(dá)與豬生長性能、豬肉品質(zhì)、繁殖性能和健康狀況的影響也是非常有必要的。豬作為重要的畜牧經(jīng)濟(jì)動物和模式動物，探明miRNA調(diào)節(jié)其生長性能、肉品質(zhì)、繁殖性能和健康狀況的潛在機(jī)理，可為提升豬生產(chǎn)性能、改善豬肉品質(zhì)以及分子育種提供新的實試驗證據(jù)。此外，還可以為治療人類代謝疾病、生殖疾病等提供新的思路。

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(責(zé)任編委: 李明洲)

Advances in porcine miRNAome

Maoliang Ran1,2, Bin Chen1,2, Jie Yin3,4, Anqi Yang1,2, Zhi Li1,2, Ming Jiang1,2

1. College of Animal Science & Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
2. Hunan Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement of Domestic Animal, Changsha 410128, China;
3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
4. University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

MicroRNA (miRNA), a class of non-coding RNA (about 22 nt), widely exists in different organisms and plays an important role in growth, development, and apoptosis. Recently, many studies have shown that miRNAs serve as a regulatory mechanism in mediating the development of pig muscle, fat, reproductive and immunity traits. The next-generation of high-throughput sequencing technology plays a critical role on finding new miRNAs and identifying their different expressions in pig. In this review, we summarize the application of the next-generation of high-throughput sequencing technology in the study of pig miRNAs as well as the regulatory roles of several important miRNAs in fat metabolism, muscle development, oocyte maturation and development of B cells and T cells. This review will provide insight into the research on pig miRNAs, and some ideas on how to improve pork quality, growth, reproductive and immunity performance.

2014-05-04;

2014-08-18

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-36)資助

冉茂良，博士研究生，專業(yè)方向：豬的遺傳育種。E-mail: ranmaoliang0903@126.com

陳斌，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：豬的遺傳育種。E-mail: chenbin7586@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0974

時間: 2014-9-17 17:24:14

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140917.1724.003.html