朱曉媛 胡 鐵 張 蕾 蔣麗娟 黎繼烈

(中南林業(yè)科技大學經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室1，長沙 410004)

(廣州航海學院2，廣州 510725)

纖維素酶是水解纖維素類物質的一組酶的總稱，廣泛應用于食品、飼料、農副產品深加工、新能源生產等領域。纖維素酶作為新型飼料添加劑，顯著提高飼料消化率和利用率，改善家禽生產性能［1－2］。近年來，纖維素酶在農產品深加工及副產品綜合利用方面受到越來越多的關注。利用纖維素酶水解秸稈、稻殼等農業(yè)副產品制備還原糖，進而生產燃料乙醇、乳酸等［3－4］。利用單一纖維素酶或以纖維素酶為主的復合酶輔助提取植物油如玉米胚芽油［5］、菜籽油［6］、橡膠籽油［7］等，顯著提高油脂得率。另外，新型纖維素酶改性農業(yè)秸稈制備的水體溢油吸附劑性能良好，綠色環(huán)保，具有較好的應用前景［8］。然而，纖維素酶的高成本成為限制其大規(guī)模生產應用的瓶頸［9］。纖維素酶來源廣泛，細菌、放線菌和真菌均可生產纖維素酶。細菌和放線菌生產的纖維素酶是胞內酶，不僅產量低，而且對結晶纖維素不具酶活性［10］。因而纖維素酶大多是由絲狀真菌生產，包括曲霉、木霉和青霉等。曲霉分泌的葡聚糖纖維二糖水解酶活性低，木霉無法利用木質素且分泌的β－葡萄糖苷酶活性低，因而在一定程度上限制了其應用生產。青霉具有分泌纖維素酶組分齊全、酶活較高的生物學特性，而且具有易培養(yǎng)和生長快的優(yōu)勢［11］。然而，目前已報道的青霉纖維素酶生產水平較低，酶活較低［12－13］，不能滿足日益增長的市場需求。本試驗以實驗室自行分離得到的高產菌株青霉Penicillium sp.1407為研究菌株，利用廉價的麩皮作為碳源，采用單因素和Box－Behnken試驗對其進行發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在獲得最優(yōu)培養(yǎng)條件，提高目標菌種產纖維素酶效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:本實驗室自行分離，經鑒定為青霉Penicillium，命名為 Penicillium sp.1407。

活化培養(yǎng)基:麩皮5%、瓊脂2%。

種子培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基、馬鈴薯20%、蔗糖2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮2.95%、藥媒3.18%、胰蛋白胨0.4%、微晶纖維素 3.79%、磷酸二氫鉀 0.25%、硫酸鎂 0.03%、氯化鈣0.03%、硫酸銨 0.2%。

試劑:葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸、羧甲基纖維素鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、3，5－二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氫氧化鈉等，均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將斜面保存菌種移接于新鮮的活化培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)5～6 d。再用250 mL搖瓶裝種子培養(yǎng)基50 mL，接斜面活化好的菌種兩環(huán)，在28℃、搖床轉速180 r/min條件下培養(yǎng)1～2 d制備種子液。以一定接種量將種子液轉接于發(fā)酵搖瓶中，500 mL搖瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL，按照一定的發(fā)酵條件培養(yǎng)。所得發(fā)酵液于8 000 r/min，4℃離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 纖維素酶活力測定

取經40℃預熱的稀釋粗酶液0.5 mL，加入經40℃預熱的CMCNa液1.5 mL，40℃恒溫振蕩反應20 min，立即加入DNS試劑3 mL，沸水浴中煮沸7 min，終止反應，加入蒸餾水10 mL混勻，冷卻后測定還原糖的含量。

纖維素酶活力定義:在pH 4.8，40℃條件下，單位體積纖維素酶每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定義為一個酶活力單位(IU/mL)。

1.2.3 單因素試驗

《明報》之后，他的江湖早只剩下了武俠的江湖，曾經縱橫論政、夜半文章的政論世界早已消失。但如果靠著他的武俠小說，他建造的這個江湖世界也許真的可做到以一人敵一國，那是母語的力量，是他用母語造出來的一個世界?？梢哉f，他創(chuàng)造了一個人的江湖，這里有水深浪闊、風波不息，也曾有俠骨柔情、劍膽琴心，哪怕如今只留下渾渾噩噩、茍茍且且。

由單因素試驗確定發(fā)酵條件(搖床轉速、發(fā)酵溫度、接種量、初始 pH、發(fā)酵時間)對 Penicillium sp.1407產纖維素酶的影響，每組做3個平行試驗。

1.2.4 Box－Behnken試驗

依據(jù)單因素試驗結果，選取對發(fā)酵過程影響較大的因素進行Box－Behnken試驗，運用統(tǒng)計軟件SAS 8.1對試驗結果進行分析，確定最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 搖床轉速對纖維素酶活力的影響

搖床轉速對纖維素酶活力的影響如圖1所示，搖床轉速低于180 r/min時，發(fā)酵液中纖維素酶活力較低。這是因為轉速過低影響菌絲體的分散，不利于菌種對培養(yǎng)基養(yǎng)分的吸收利用，也不利于菌絲體伸展，抑制其呼吸作用。搖床轉速為220 r/min時維素酶活力較高，這是由于加大轉速可增大通氣量，提高發(fā)酵液中溶氧濃度，因而有助于菌體生長并提高菌種產酶活性。但過高轉速可能增加剪切力，影響菌絲生長和代謝，不利于產酶。因此選擇搖床轉速范圍為200～230 r/min。

圖1 搖床轉速對纖維素酶活力的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響

發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響結果如圖2所示，纖維素酶活力隨著溫度的遞增而呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，32℃時酶活力最高，是因為微生物的生長代謝和產物合成都需要在合適的溫度下進行，在發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溫度環(huán)境。溫度的變化不僅影響微生物體內許多生化反應類型，也影響微生物細胞中生化反應的速度。不同微生物都有自己適宜的生長溫度范圍，溫度不同代謝產物的合成與積累也會有所不同。因此選擇30～33℃為后續(xù)試驗培養(yǎng)溫度范圍。

圖2 發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響

2.1.3 接種量對纖維素酶活力的影響

分別以接種量為1%、3%、5%、10%、15%的水平進行發(fā)酵試驗，測定纖維素酶活力，結果如圖3所示。接種量低于5%時，纖維素酶活力較低，這可能是因為接種量過小，發(fā)酵前期菌體增長緩慢，增殖時間延長，同時影響菌種的活力，不利于產物合成;接種量超過5%之后，纖維素酶活力有所降低，是因為菌體過多導致營養(yǎng)成分不能滿足正常的生長代謝或溶氧不足從而影響菌體產酶。接種量為5%時纖維素酶活力最高，因此確定最適接種量為5%。

圖3 接種量對纖維素酶活力的影響

2.1.4 初始pH對纖維素酶活力的影響

初始pH對纖維素酶活力的影響如圖4所示，纖維素酶活力在初始pH 4.0～6.0之間有較高的酶活，當初始pH為5.0時酶活最高，這是因為初始pH不僅對微生物的生長有影響，還會影響到代謝產物的形成，從而影響纖維素酶的活力。pH影響微生物細胞原生質膜的電荷進而影響營養(yǎng)物質的吸收及代謝產物的滲漏，同時還會影響營養(yǎng)物質和中間代謝產物的離解進而影響到代謝產物的質量和產量。因此選擇初始pH 4.5～5.5為最佳初始pH范圍。

圖4 初始pH對纖維素酶活力的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響

在搖瓶發(fā)酵過程中，每隔12 h分別取樣測定酶活。發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響結果如圖5所示，在0～48 h，纖維素酶活力增長緩慢;隨著發(fā)酵時間延長，酶活逐漸升高，在144 h酶活達到最高，隨后酶活呈下降趨勢。這是因為青霉纖維素酶是一類胞外酶，在分泌過程中會有高峰期存在，酶在高峰期的穩(wěn)定性因培養(yǎng)基的不同而具有較大的差異性，且慢發(fā)酵時間對纖維素酶的生產具有很大的影響，需要準確控制。因此選擇132～144 h為最佳培養(yǎng)時間范圍。

圖5 發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響

2.2 Box－Behnken試驗結果與分析

根據(jù)單因素試驗的結果，選擇搖床轉速(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、初始pH(X3)、發(fā)酵時間(X4)為影響因素，采用Box－Benhnken試驗設計對發(fā)酵條件進行四因素三水平的響應面分析優(yōu)化，試驗設計及結果如表1～表2所示。

表1 Box－Behnken試驗因素與水平

表2 Box－Behnken試驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析

應用統(tǒng)計軟件SAS8.1對試驗所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，結果如表3所示，模型P＜0.01，表明回歸模型極顯著，相關系數(shù)R2=0.961 0，表明該模型擬合程度較好。所得二次回歸擬合方程為:

Y=135.52+1.45X1+0.24X2+1.51X3+0.19X4－4.86X1X1+1.14X1X2+4.74X1X3+3.08X1X4－4.94X2X2+5.43X2X3+0.08X2X4－ 4.92X3X3+0.07X3X4－4.76X4X4

對回歸方程求解并修整，得到各因素最佳值分別是:發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時間142 h、初始pH 5.2、轉速230 r/min，纖維素酶的酶活達到理論最大值136.16IU/mL。利用Statistica6.0軟件根據(jù)回歸模型進行響應面分析，繪出響應面分析圖及其等高線，如圖6所示，X1與X3，X1與X4，X2與X3交互影響明顯，即發(fā)酵溫度與初始pH、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間、轉速與初始pH交互效應顯著。

圖6 兩因素交互影響纖維素酶活力的響應面和等高線圖

2.3 驗證試驗

根據(jù)上述優(yōu)化的Penicillium sp.1407發(fā)酵產纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，即發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時間142 h、初始 pH 5.2、轉速230 r/min，進行3 次平行試驗，測得纖維素酶活為(136±0.74)IU/mL，與擬合回歸方程最佳預測值相比誤差為0.54%，說明回歸模型真實可靠。

3 結論

通過單因素和Box－Benhnken試驗對Penicillium sp.1407產纖維素酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。獲得最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時間142 h、初始pH 5.2、轉速230 r/min，在該條件下，纖維素酶活可達(136 ±0.74)IU/mL，較優(yōu)化前提高了17.73%。

纖維素酶應用于農產品深加工及副產品綜合利用，可提高農副產物的附加值。但是目前纖維素酶的生產成本較高，因此從發(fā)酵水平提高纖維素酶活具有重要的意義，本研究可為進一步放大發(fā)酵生產纖維素酶提供理論依據(jù)。

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