楊相政 李喜宏 馬宏原 申靈敏

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

飼料在生產(chǎn)、加工、運輸儲藏過程中會因為各種自然環(huán)境因素使飼料的原有養(yǎng)分降低和品質(zhì)的劣化，嚴(yán)重者導(dǎo)致畜禽采食后中毒或死亡［1－2］。飼養(yǎng)的動物食用了細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)的飼料，一旦免疫力降低，就會引發(fā)疾病，給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失。影響飼料品質(zhì)最重要的因素是霉菌的破壞，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計，全世界每年大約有5%～7%的糧食、飼料等農(nóng)產(chǎn)品遭受霉菌的侵蝕，全世界每年由此造成的經(jīng)濟損失可達(dá)數(shù)千億美元。我國每年因為在儲藏過程受到霉菌污染而變質(zhì)浪費的飼料占總產(chǎn)量的15%左右［3］。因此，飼料霉菌毒素感染已成為飼料工業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問題。

飼料的腐敗變質(zhì)主要是發(fā)生在儲藏期間，霉變飼料中的霉菌毒素不僅降低了飼料的營養(yǎng)價值，還會誘發(fā)畜禽的急慢性中毒，嚴(yán)重時還可造成畜禽中毒死亡，其中影響最強、毒性最大的黃曲霉毒素B1能引起動物急性中毒死亡，有強烈的致癌作用［4－5］，還會影響奶、蛋、肉等畜產(chǎn)品的質(zhì)量，直接危害人的健康。因此研究如何防止飼料的的腐敗變質(zhì)具有非常重要的現(xiàn)實意義。目前國內(nèi)外對雞飼料加工、運輸、儲藏期間防止霉菌腐敗變質(zhì)的研究主要集中在添加防腐劑、防腐包裝和射線照射結(jié)合化學(xué)處理等［5］，其中運用最多是添加防腐劑防腐。但是防霉劑不能完全保證飼料不霉變，只能在一定條件下延長飼料霉變的時間［6］，而且作用的范圍有限［7］。對于氣調(diào)儲藏飼料防霉變鮮有報道。

糧食氣調(diào)儲藏是國際上應(yīng)用較為普遍和先進的糧食儲藏方法之一，可以比較好的保持糧食品質(zhì)，殺滅害蟲，防止有害微生物的生長［8］。本試驗采用高CO2氣調(diào)儲藏技術(shù)儲藏雞飼料，通過測定分析雞飼料的細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和黃曲霉總數(shù)的變化，研究高CO2對雞飼料霉變的調(diào)控效應(yīng)，以期為CO2氣調(diào)儲藏雞飼料的應(yīng)用提供技術(shù)參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

雞飼料:天津市新星獸藥廠，主要成分為玉米60%、豆粕13%和麩皮9%，含水量11%。

1.2 主要儀器和試劑

DK－98－1型數(shù)顯恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;WH－3微型漩渦混合儀:上海滬西分析儀器有限公司;SHZ－82型恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司;YXZ280B型高壓滅菌鍋:上海三申醫(yī)療器械有限公司;YS100型Nikon生物顯微鏡:上海澤仕光電科技有限公司;手持式O2/CO2分析儀:北京卓川電子科技有限公司;甲醇:天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;毒素檢測試劑盒:上海必發(fā)生化科技有限公司

1.3 處理方法

稱取每份1 kg雞飼料裝入布袋，再放入10 L氣調(diào)瓶中，充入不同濃度的CO2和O2的混合氣體。儲藏的氣體條件為:自然空氣(CK)、2%～3%O2+30%CO2(TR1)、2%～3%O2+50%CO2(TR2)。在實驗室低溫糧食保鮮庫內(nèi)，調(diào)節(jié)TD－2型溫度梯度箱工作溫度分別為0、10、23和30℃，將各處理分別置于不同溫度的梯度箱內(nèi)，儲藏時間4月，定期使用手持式O2/CO2分析儀定期檢測氣體變化，調(diào)整氣體環(huán)境。每30 d取樣測定1次指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)菌總數(shù)

測定程序參照GB/T 13093—2006《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》方法測定。所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基。

1.4.2 霉菌總數(shù)

測定程序參照GB/T 13092—2006《飼料中霉菌總數(shù)的測定》方法進行測定。所用培養(yǎng)基為高鹽察氏培養(yǎng)基。

1.4.3 黃曲霉總數(shù)

測定程序參照GB/T 4789.16—2003《常見產(chǎn)毒菌的鑒定》對菌落進行鑒定。

1.4.4 黃曲霉毒素B1含量的檢測

利用Bcacon毒素檢測試劑盒進行飼料中毒素含量的檢測。已提供的試劑與材料有:真空包裝且包含干燥劑的8 mm×12 mm的微孔板;5瓶質(zhì)量濃度分別為 0、2.0、4.0、10、25 μg/kg 的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品;1瓶酶標(biāo)記物;1瓶底物溶液;1瓶停止液。

1.4.4.1 提取液的制備

將80 mL甲醇和20 mL蒸餾水置于錐形瓶中，震蕩搖勻。

1.4.4.2 樣品制備

粉碎后的樣品過20目篩，稱取50 g樣品和5.0 g氯化鈉置于帶塞錐形瓶中，并向其中加入100 mL甲醇/水(80∶20)提取液，搖勻，靜置2～3 min使樣品沉淀，然后用玻璃纖維濾紙過濾10 mL萃取液，取5 mL萃取液用20 mL蒸餾水稀釋，過濾稀釋液待測。

1.4.4.3 檢測程序

先將毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品液加入測試孔中，然后向測試孔中加入毒素的酶標(biāo)記物，樣品及酶標(biāo)記物競爭結(jié)合連接在微孔上的抗體，10 min培養(yǎng)后，倒掉孔中的溶液，洗掉微孔中未結(jié)合的霉菌毒素和酶標(biāo)記物，加入無色的底物溶液，培養(yǎng)10 min，所有結(jié)合的酶標(biāo)記物使底物轉(zhuǎn)化成藍(lán)色物質(zhì)。加入停止液，然后將測試孔放在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值，未知濃度樣品與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進行比較，就可以得到樣品的黃曲霉毒素B1的濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

全部試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007進行統(tǒng)計處理，采用SPSS10.0軟件檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌總數(shù)的檢測

當(dāng)溫度一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著二氧化碳濃度的升高，其抑菌效果越明顯。但是超出一定濃度界限時，隨著二氧化碳濃度升高，抑菌效果反而下降［8］。褚益可等［9］研究牛肉的氣調(diào)保鮮結(jié)果表明:不是CO2濃度越高其抑菌效果越強，當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到45%后，其抑菌能力反而隨著CO2濃度的升高而下降。

不同的氣體環(huán)境對飼料中細(xì)菌總數(shù)的影響較大(表1)。在0℃時，高濃度CO2對雞飼料抑菌效果很明顯。雞飼料在30%CO2和50%CO2的條件下儲藏90 d細(xì)菌總數(shù)都小于限量標(biāo)準(zhǔn)2×106cfu/g，前60 d細(xì)菌增長相對較慢;10℃時，30%CO2和50%CO2的條件下儲藏60 d后，細(xì)菌總數(shù)不超標(biāo);30℃時，30%CO2和50%CO2的條件下儲藏30 d內(nèi)，細(xì)菌總數(shù)不超標(biāo)。當(dāng)溫度一定時，CO2體積分?jǐn)?shù)為0%～50%的范圍內(nèi)，隨著二氧化碳濃度的升高，對細(xì)菌生長的抑制就越明顯(圖1)。

表1 細(xì)菌菌落總數(shù)均值

圖1 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲藏60 d后細(xì)菌菌落圖

2.2 霉菌總數(shù)的檢測

氣體對真菌的代謝活動有明顯影響。高濃度二氧化碳?xì)怏w環(huán)境下，霉菌孢子很難萌發(fā)，繁殖較慢［9］。

如表2和圖2可知，當(dāng)溫度一定，高濃度的CO2對霉菌的生長有明顯的抑制作用。0℃時，30%CO2下，霉菌生長極其緩慢，儲藏120 d后，霉菌總數(shù)遠(yuǎn)小于對照組(CK)，低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)4.5×103cfu/g;50%CO2時，霉菌幾乎不生長，總數(shù)基本不變。10℃時，CO2體積分?jǐn)?shù)為30%和50%條件下，飼料儲藏120 d后，霉菌總數(shù)不超標(biāo)，而對照組儲藏60 d后，霉菌總數(shù)超過限量標(biāo)準(zhǔn)，飼料已經(jīng)霉變。30℃時，高濃度的CO2對霉菌的抑制效果不是特別顯著，CO2體積分?jǐn)?shù)為30%和50%時，飼料儲藏超過60 d霉菌均低于限量標(biāo)準(zhǔn)。對照組儲藏30 d后，霉菌已經(jīng)超標(biāo)，飼料的營養(yǎng)成分已經(jīng)受到霉菌的破壞。

表2 霉菌菌落總數(shù)均值

圖2 雞飼料不同濃度CO2處理同一稀釋濃度下儲藏60 d后霉菌菌落圖

2.3 黃曲霉總數(shù)的檢測

當(dāng)二氧化碳體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%以上時，能抑制小麥或玉米內(nèi)的霉菌生長及青霉或黃曲霉毒素的產(chǎn)生［10－11］。由表3和圖3可知，高濃度 CO2明顯抑制雞飼料內(nèi)黃曲霉的生長，并且濃度越高，效果越明顯。當(dāng)溫度為0℃和10℃時，50%CO2對黃曲霉生長抑制顯著，黃曲霉生長緩慢;當(dāng)溫度為30℃時，抑菌效果不顯著，這與霉菌總數(shù)增長趨勢一致?？梢姡邼舛菴O2對于常溫和低溫儲藏下的雞飼料內(nèi)霉菌的生長抑制效果顯著，而對于高溫儲藏下的雞飼料內(nèi)的霉菌生長抑制效果不顯著。

表3 黃曲霉菌菌落總數(shù)均值

圖3 飼料中黃曲霉菌落的不同形態(tài)

2.4 常溫儲存下黃曲霉毒素隨時間的變化情況

高濃度CO2處理可有效抑制雞飼料常溫儲藏過程中黃曲霉毒素B1含量的變化，而對照組黃曲霉毒素B1含量變化很大。由圖4可知，儲藏到90 d，30%CO2和50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量分別為 19.3 μg/kg 和 12.6 μg/kg，均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)20μg/kg。儲藏到120d，50%CO2處理的雞飼料黃曲霉毒素B1的含量為17.4 μg/kg，仍低于國家標(biāo)準(zhǔn)，而對照組黃曲霉毒素B1的含量為56.2 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出國家標(biāo)準(zhǔn)，而且飼料已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重霉變，顏色變黑，有惡臭，幾乎失去使用價值。因此高濃度的能有效抑制飼料中霉菌特別是黃曲霉的生長，進而抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。

圖4 不同濃度CO2處理對黃曲霉毒素B1含量的影響

3 結(jié)論

3.1 當(dāng)溫度一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，CO2濃度越高，對雞飼料內(nèi)細(xì)菌和霉菌的抑制效果越顯。高濃度的CO2對于常溫和低溫儲藏下的雞飼料內(nèi)霉菌的生長抑制效果顯著，而對于高溫儲藏下的雞飼料內(nèi)的霉菌生長抑制效果不顯著。

3.2 高濃度CO2對于室溫下儲藏的雞飼料內(nèi)黃曲霉的生長以及黃曲霉毒素B1含量的變化有明顯的影響，50%CO2處理能明顯抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生，進而防止飼料霉變變質(zhì)。

3.3 10℃ +30%CO2和常溫+50%CO2的儲藏環(huán)境可有效抑制雞飼料內(nèi)細(xì)菌和霉菌的生長，用于雞飼料防霉儲藏。雞飼料在此條件下儲藏90 d細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)以及黃曲霉毒素均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

［1］Battacone G，Nudda A，Cannas A，et al.Excretion of aflatoxin M1 in milk of dairy ewes treated with different doses of aflatoxin B1［J］.Journal of dairy science，2003，86(8):2667 －2675

［2］Whitlow L W，Hagler Jr W M.Mycotoxins in feeds［J］.Feedstuffs，2002，74(28):68 －78

［3］楊在賓，劉麗，杜明宏.我國飼料業(yè)的發(fā)展及飼料資源供求現(xiàn)狀淺析［J］.飼料工業(yè)，2008，29(19):45－49

［4］楊麗梅，申光榮.飼料中霉菌毒素的危害及其預(yù)防［J］.飼料工業(yè)，2003，24(12):53 －55

［5］姜翠翠，王昌祿，王文杰，等.濃縮飼料中霉菌總數(shù)及霉菌毒素含量變化的研究［J］.飼料工業(yè)，2008，29(7):22 －24

［6］蘇希孟，孫盤龍.霉變飼料處理方法與預(yù)防途徑［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2010(2):38－40

［7］馬佳，楊桂芹.飼料防霉劑及其應(yīng)用效果的評價分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011(11):21－24

［8］曠春桃.淺談影響飼料防霉劑使用效果的幾個因素［J］.湖南畜牧獸醫(yī)，2001(1):14

［9］褚益可，雷橋，歐杰.氣調(diào)包裝中氣體濃度對牛肉保鮮的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(4):266 －232

［10］國娜，王賀.淺析氣調(diào)儲藏技術(shù)對糧食儲藏生物環(huán)境的影響［J］.黑龍江糧食，2011(3):40－42

［11］羅建偉，李榮濤，陳蘭，等.CO2氣調(diào)儲糧技術(shù)對糧食真菌的抑制效果研究［J］.糧食儲藏，2003，32(6):34－41.