張 華 陳旭義 楊 波 張明華 王仁杰

在生物體內(nèi)不同的生理過程，諸如發(fā)育、分化、增值、凋亡、病毒感染以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，特異性的miRNA發(fā)揮著重要的作用［1-3］。miRNA是通過對其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)節(jié)發(fā)揮作用的。目前，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，miRNA在肝細胞癌（hepato?cellular carcinoma，HCC）或肝癌細胞中的表達量相對正常組織或細胞有非常明顯，諸如，miR-122a、miR-221/222、miR-21、miR-224、miR-34a等，而且某些miRNA與HCC的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后等臨床病理特性相關(guān)。本研究利用實時熒光定量PCR檢測肝細胞肝癌患者血清miR-224水平變化，旨在探討其臨床診斷意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本院2012年1月至12月收治的原發(fā)性肝細胞肝癌患者42例，其中男24例，女18例，平均年齡（53.2±7.3）歲。按照2002年美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期標準進行TNM分期，Ⅰ期6例、Ⅱ期11例、Ⅲ期14例和Ⅳ期11例。36例肝硬化患者（LC），其中男19例，女17例，平均年齡（51.1±6.5）歲。HCC和LC患者均經(jīng)病理診斷確診。55例慢性乙型肝炎患者（CHB），其中男30例，女25例，平均年齡（52.8±8.9）歲。所有患者排除其他腫瘤或病毒感染疾病。另同期40例健康體檢者（NC）作為正常對照組。所有入組患者在采集血液標本前均未經(jīng)手術(shù)、放療以及化療。隨機組患者與對照組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性（P＞0.05）。在采集樣本前均獲得患者的知情同意，獲本院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 血清標本采集及總RNA提取 收集每例待檢者外周血3 mL置于不含乙二胺四乙酸（EDTA）的試管中，在室溫靜置30 min后取1.0 mL上清液，4℃、820 g離心10 min；取上清液后4℃、16 000 g離心10 min，取上清液到新的離心管中，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

按照RNA提取試劑盒Trizol Reagent（Invitrogen，美國）的操作說明提取血清總RNA。利用紫外分光光度計NanoDrop ND-1000（NanoDrop，Wilmington，美國）測定RNA濃度和純度。要求總RNA溶液的A260/A280在1.8～2.1范圍之內(nèi)，否則再次提取。利用1%變性瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA提取的質(zhì)量。獲得的RNA溶液于-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測血清miR-224表達量 應(yīng)用iScript cDNA synthesis kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bio-Rad，美國），按照說明書將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，主要反應(yīng)條件：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min。以合成的cDNA為模板，應(yīng)用 iQTMSYBR?Green Supermix試劑盒（Bio-Rad，美國），按照說明書進行實時熒光定量PCR。同時以U6小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）管家基因作為內(nèi)參照。運用Primer Premier 5.0軟件進行設(shè)計miRNA-224和U6的特異性引物，miRNA-224引物：s：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGC ACTGGATACGACTAAACG-3'，as：5'-CGCAAGTCCT AGTGGTTCCG-3'。U6 引物：s：5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，as：5'-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。實時熒光定量PCR檢測在Bio-Rad iQ5定量PCR儀器上進行反應(yīng)。PCR反應(yīng)循環(huán)條件：第1步，95℃預(yù)熱3 min；第2步，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)。熔解曲線分析0.5℃/0.5 min：55℃～95℃。在Bio-Rad熒光定量PCR-iQ5軟件進行分析。每個miRNA的相對表達量用2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=（CtHCC-miR224-CtHCC-U6）-（CtNC-miR224-CtNC-U6）每個樣本重復(fù)3次試驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗、相關(guān)性分析。計量資料以表示。通過受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC）判斷miRNA-224表達水平在肝癌診斷中的靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-224在NC，CHB，LC，HCC患者血清的表達量

參照公式計算2-ΔΔCt，分別算出miR-224在CHB，LC，HCC患者血清中的平均相對表達量（差異倍數(shù)）（表1，圖1）。3組患者血清miR-224相對表達量均高于NC組，其中LC和HCC組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HCC組和LC組高于CHB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HCC組高于LC組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 HCC患者血清miR-224相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系

HCC血清miR-224相對表達量與臨床病理特征的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示HCC血清miR-224相對表達量與AFP呈正相關(guān)（P＜0.01）；但是與腫瘤大小、TNM分期、腫瘤分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P＞0.05，表2）。

表1 miR-224在NC,CHB,LC,HCC患者血清的相對表達量Table 1 Relative expression of miR-224 in the serum of NC,CHB,LC,and HCC groups

圖1 miR-224在NC，CHB，LC，HCC患者血清的相對表達水平Figure 1 Relative expression of miR-224 in the serum of the NC，CHB，LC，and HCC groups

表2 HCC患者血清miR-224相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship between the relative expression of miR-224 in the serum of the HCC group and clinico-pathological features

2.3 HCC患者血清miR-224對HCC診斷的敏感性和特異性

通過受試者工作特征曲線分析血清miRNA-224相對表達量在肝癌診斷中的靈敏度和特異度，分析結(jié)果確定了最佳的miR-224相對表達量的臨界值為3.47，靈敏度被確定為82.2%，特異性為92.8%，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.935（圖2）。提示采用實時熒光定量PCR檢測血清miRNA-224的相對表達量，作為肝癌的生物標志物的檢測有一定的準確性和可行性。這為高效準確診斷肝癌提供了一定的指導(dǎo)意義。

圖2 HCC患者HCC血清miR-224相對表達量的ROC曲線Figure 2 ROC of the relative expression of miR-224 in the serum of the HCC group

3 討論

肝癌是最常見的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤中其發(fā)病率位居第二，在美國惡性腫瘤相關(guān)疾病中其死亡率位居第五位［6］，具體發(fā)病機理仍不十分清楚，其早期診斷仍較困難。在大量的HCC病例研究中，人們認識到HCC的發(fā)生發(fā)展過程中涉及到一系列基因的改變［7］，但對其具體的分子機制并不清楚。尋找肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)基因，了解肝癌的分子遺傳學(xué)機制從而為肝癌的診斷、治療提供理論基礎(chǔ)是目前的研究熱點。

隨著對miRNA的了解越來越深入，miRNA在臨床中的應(yīng)用會越來越廣泛。由于miRNA序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達方式的多樣性，決定了其在人類腫瘤信號通路中所起到的重要作用，而且不同腫瘤中有其特異性的miRNA表達譜［8］。研究表明，miRNA在血清和血漿中也可能有穩(wěn)定的表達，血清或血漿放置在常溫24 h以上或在強酸強堿環(huán)境中以及反復(fù)冰凍及融解樣本多次也不影響miRNA的穩(wěn)定性，采用基于莖環(huán)的RT-PCR方法證明了血漿中miRNA耐核糖核酸酶的，是非常穩(wěn)定的，并且血漿和血清中的樣本檢測有很好的相關(guān)性，都很適合作為血液基礎(chǔ)的標記物，提示可以作為潛在的特異性腫瘤標志物［9-11］。多項研究發(fā)現(xiàn)［12-16］，肝臟組織特異性的miRNAs在一些惡性肝組織或者細胞中相較正常組織或細胞有非常明顯的變化，其中miR-224就是其中之一，它在肝細胞肝癌患者組織中高表達。

目前，國內(nèi)外較少有關(guān)于檢測特異性miRNA用于肝癌的臨床診斷的報道。而且通過檢測患者血清miRNA用于臨床診斷的更為少見。目前腫瘤患者某些外周血miRNA升高的原因可能是在腫瘤組織中超表達的miRNA以一定的方式釋放入外周血中，具有腫瘤特異性，有可能作為一種新型的腫瘤標志物。本研究通過提取血清miRNA，進行實時熒光定量PCR驗證，檢測和分析了肝細胞肝癌患者、肝硬化患者、慢性乙型肝炎患者、40例健康體檢者血清中miR-224表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝細胞肝癌患者血清miR-224水平較健康者有明顯升高（P＜0.01），且高于肝硬化患者、慢性乙型肝炎患者（P＜0.05或P＜0.01），肝癌患者血清miR-224水平變化趨勢與國內(nèi)外研究結(jié)果趨于一致［12-16］。研究結(jié)果提示血清miR-224異常大幅度增高，可能是肝細胞肝癌的一個重要血清指標，對早期無癥狀肝癌的診斷有一定指示作用。分析HCC患者血清miR-224相對表達量與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-224與AFP含量呈正相關(guān)（P＜0.01）。同時研究發(fā)現(xiàn)在TNMⅠ和Ⅱ期肝細胞肝癌患者血清中的表達明顯上調(diào)，進一步提示血清miR-224水平可以作為早期診斷有一定的參考意義。雖然在TNMⅠ和Ⅱ期肝細胞肝癌患者血清中的表達明顯上調(diào)，而這種特異性表達上調(diào)與腫瘤的TNM分期、是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度統(tǒng)計學(xué)分析無明顯關(guān)系（P＞0.05），可能與組織樣本量少有關(guān)，也有可能提示血清miR-224水平變化無法作為腫瘤進展的觀測指標。

通過ROC分析HCC患者血清miR-224對HCC診斷的敏感性和特異性發(fā)現(xiàn)，最佳的miR-224相對表達量的臨界值為3.47，靈敏度被確定為82.2%，特異性為92.8%，曲線下面積（AUC）為0.935。這進一步支持了血清miRNA-224作為肝細胞肝癌的生物標志物有一定的準確性和可行性。本研究采用抽取患者血清方式，且運用一種準確的、重現(xiàn)性好、高效的熒光定量PCR法進行檢測。因此，這在臨床應(yīng)用上能夠早期、便捷、有效的提示癌變?；颊哐錷iR?NA-224水平的檢測為今后在臨床上展開新的更高效的肝癌診斷方法提供了一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，miR-224在肝細胞肝癌患者血清表達明顯升高，對肝細胞肝癌診斷名感性和特異性高，它有可能成為一種新的血清學(xué)指標用于肝細胞肝癌的診斷。

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