陳 凱 常東方 段紹坤 李渝涼

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）是我國常見的皮膚惡性腫瘤，具有高度的侵襲能力，可能與紫外照射損傷、免疫抑制及其他皮膚疾病有關(guān)［1］。因此，尋找其發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子對其治療是必要的。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［2］。

miRNA是一類比較保守的單鏈非編碼小RNA分子，主要通過與靶基因mRNA 3'UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達［3，4］。miRNA參與一系列的生理過程，如生長、發(fā)育、分化及凋亡［5］。研究發(fā)現(xiàn)約50%miRNA基因定位于染色體上腫瘤基因相關(guān)區(qū)域，并且在腫瘤中經(jīng)常伴隨著miRNA的異常表達［6］。關(guān)于miRNA與皮膚鱗癌的研究在國內(nèi)外報道甚少，有研究表明在皮膚鱗癌中miR-125b通過靶定MMP-13抑制鱗癌細(xì)胞的生長和侵襲遷移［7］。此外，通過對皮膚鱗癌和其他皮膚腫瘤患者中miRNA表達水平的分析，發(fā)現(xiàn)miR-31在皮膚鱗癌中高表達［8］。然而，關(guān)于miR-31在皮膚鱗癌中的作用還未明確。

本研究探索了miR-31對細(xì)胞增殖以及腫瘤生長的影響，并對其靶基因進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究20對皮膚鱗癌和癌旁正常組織來自2011年1月至2013年6月重慶醫(yī)科大學(xué)永川醫(yī)院收治患者，并得到患者的知情同意。鱗癌細(xì)胞A431和SLC-1的培養(yǎng)液是含有10%FBS的DMEM（Gibco公司）。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，ASO和siRNA購自上海吉瑪公司。兔抗LATS2和GAPDH抗體購自Abcam公司。RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄酶購自Fermentas公司，實時定量PCR的2×SYBR Green Master Mix購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照脂質(zhì)體的說明進行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 h后，換含有血清的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 平板克隆形成實驗 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種到12孔板，每隔3天換液至到大部分克隆形成。用PBS清洗后5%濃度結(jié)晶紫染色，并進行計數(shù)。

1.2.3 體外成瘤實驗 裸鼠購自北京維通利華有限責(zé)任公司（動物合格證號：SCXK（京）2013-0002），并得到動物管理委員會的許可。裸鼠在無菌的條件下正常飲食，將106個轉(zhuǎn)染的鱗癌細(xì)胞重懸在100 μL無血清培養(yǎng)液中，經(jīng)皮下注射途徑植入裸鼠。大概3周后，將小鼠麻醉處死取出腫瘤組織，并量取體積。體積=（長×寬2）/2。

1.2.4 Western印跡 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LATS2的siRNA（20 nM）以及對照，48 h后提取蛋白進行Western印跡分析LATS2的水平。轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS洗細(xì)胞后用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞。利用BCA法進行蛋白濃度測定，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE膠分析。最后利用ECL顯影，并分析條帶的強度。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 RNA提取和實時定量PCR 利用RNA提取試劑盒進行RNA提取，采用NanoDrop ND-1000分光光度計測定RNA的濃度。取500 ng RNA進行cDNA的合成后進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件是：95℃30 s，之后40個循環(huán)95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s。以U6 RNA和β-actin作為內(nèi)參。

1.2.6 免疫組織化學(xué) 將石蠟包埋的組織切片進行脫蠟水合處理，3%H2O2室溫孵育5 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后，用5%山羊血清封閉10 min，滴加一抗工作液孵育1 h。然后用生物素標(biāo)記的二抗工作液37℃孵育10 min。最后滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗后顯色劑顯色3 min，在顯微鏡下觀察。

1.2.7 GFP報告載體實驗 將含有miR-31結(jié)合位點的LATS2 3'UTR克隆到pcDNA3/GFP載體的GFP下游。在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-31 ASO和LATS2 3'UTR，同時轉(zhuǎn)染RFP質(zhì)粒作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48 h后，用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白，熒光分光光度計檢測細(xì)胞GFP熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，比較兩組數(shù)據(jù)間的差異采用雙側(cè)樣本的Student's t檢驗，比較相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。P＜0.05被認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平板克隆形成實驗分析miR-31對細(xì)胞生長的影響

將miR-31 ASO以及對照轉(zhuǎn)染A431和SLC-1細(xì)胞，利用平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長的情況。轉(zhuǎn)染miR-31 ASO的A431細(xì)胞克隆數(shù)較對照組減少約50%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在SLC-1細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。

2.2 體外成瘤實驗分析miR-31對腫瘤生長的影響

將轉(zhuǎn)染miR-31 ASO以及對照的細(xì)胞經(jīng)皮下注射入裸鼠體內(nèi)，利用體內(nèi)成瘤模型檢測miR-31對腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-31 ASO的鱗癌細(xì)胞成瘤能力降低，腫瘤體積明顯小于對照組（圖1），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 體外成瘤實驗檢測miR-31對鱗癌生長的影響Figure 1 In vitrotumor formation assay indicates that miR-31 inhibition suppresses cSCC growth

2.3 Western blot印跡檢測miR-31對LATS2蛋白水平的影響

研究證實miR-31可以靶定抑癌基因LATS2和PPP2R2A［9］。為了檢測在皮膚鱗癌中miR-31是否也通過這兩個基因發(fā)揮作用，首先通過Western印跡檢測miR-31 ASO對LATS2和PPP2R2A表達水平的影響。實驗顯示鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-31 ASO后使LATS2的水平升高約1.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，P＜0.05），而對PPP2R2A的表達水平無影響（P＞0.05）。

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測miR-31的候選靶基因

利用生物信息學(xué)方法（TargetScan以及Pictar預(yù)測網(wǎng)站）對miR-31與候選靶基因的結(jié)合位點進行驗證，圖3顯示miR-31與候選靶基因LATS2 3'UTR的結(jié)合位點互補。

圖2 Western blot檢測miR-31對候選靶基因蛋白表達的影響Figure 2 Western blot shows that miR-31 inhibition increases LATS2 protein levels

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測miR-31的靶基因Figure 3 Bioinformatics indicates that LATS2 3'UTR has binding sites with miR-31

2.5 GFP報告載體實驗驗證miR-31的靶基因

在A431和SLC-1細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-31 ASO和野生型或者突變型的LATS2 3'UTR（突變位點如圖3所示），通過GFP報告載體實驗檢測miR-31對LATS2 3'UTR熒光強度的影響。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-31 ASO的細(xì)胞中LATS2 3'UTR的熒光強度較對照組增強50%（圖4），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且在兩種鱗癌細(xì)胞中結(jié)果一致。然而miR-31 ASO對突變的3'UTR熒光強度無明顯影響（P＞0.05，圖4）。

2.6 Western blot檢測siRNA對LATS2表達水平的影響

在A431和SLC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LATS2 siRNA以及對照，轉(zhuǎn)染48 h后利用Western blot檢測細(xì)胞中LATS2蛋白水平。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LATS2 siRNA的細(xì)胞中LATS2的水平較對照組降低約80%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5，P＜0.05）。

圖4 GFP報告實驗驗證miR-31的靶基因Figure 4 GFP reporter assay shows that miR-31 inhibition increases the GFP intensity of LATS2 3'UTR

2.7 平板克隆形成實驗分析LATS2對細(xì)胞生長的影響

在A431和SLC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LATS2 siRNA以及對照，利用平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染LATS2 siRNA的細(xì)胞克隆數(shù)分別升高約70%和1.3倍，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6，P＜0.05）。

2.8 實時定量PCR分析miR-31的表達水平

利用實時定量PCR檢測miR-31和靶基因在鱗癌以及癌旁正常組織中的表達水平。圖7顯示，與癌旁正常組織相比，鱗癌組織中miR-31的水平升高約2.5倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且miR-31與LATS2的表達呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

2.9 免疫組織化學(xué)法檢測LATS2在鱗癌組織中的表達

利用免疫組織化學(xué)檢測LATS2在鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達水平。圖8顯示，與正常組織相比，皮膚鱗癌組織中LATS2的表達水平明顯降低。

圖5 Western blot檢測LATS2的表達以及平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞生長Figure 5 Western blot shows that LATS2 expression is repressed by in?troduction of siRNA against LATS2

圖6 平板克隆形成實驗檢測LATS2對細(xì)胞生長的影響Figure 6 Colony formation assay shows that knocking down of LATS2 in?creases the number of colonies

圖7 實時定量PCR檢測miR-31和LATS2在鱗癌組織和正常對照中的表達水平Figure 7 Real-time PCR shows that miR-31 is upregulated in cSCC tis?sues,and an inverse relationship exists between miR-31 and LATS2 ex?pression levels

圖8 免疫組織化學(xué)檢測LATS2在鱗癌組織和正常對照中的表達水平（SP×200）Figure 8 Immunohistochemistry shows that LATS2 is downregulated in cSCC tissues（SP×200）

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-31在鱗癌組織中高表達，抑制miR-31的表達后細(xì)胞克隆形成能力下降，腫瘤生長受抑制。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-31可促進血管平滑肌細(xì)胞生長［10］。此外，在食管鱗癌和結(jié)腸癌中，miR-31也是高表達，并且與腫瘤的進展程度相關(guān)［11-12］，這些均提示miR-31發(fā)揮著癌基因的角色。

miRNA與靶基因3'UTR的不完全互補，是導(dǎo)致一個miRNA調(diào)控多個靶基因表達的原因之一［13］。研究證實在肺癌和血管平滑肌細(xì)胞中miR-31可以通過靶定PPP2R2A和LATS2參與細(xì)胞的生長。在本研究中，抑制miR-31的表達后，LATS2蛋白水平升高，而PPP2R2A的表達不受影響。這可能是PPP2R2A的3'UTR在不同的腫瘤細(xì)胞中有差異，導(dǎo)致miRNA的抑制作用消失。此外，通過GFP報告實驗進一步驗證LATS2是miR-31的直接靶基因，miR-31通過與其3'UTR直接結(jié)合而抑制其表達。

LATS2定位于13號染色體，可編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶。研究發(fā)現(xiàn)該酶屬于Hippo腫瘤抑制信號途徑的成員，可以通過磷酸化的形式使癌基因YAP失活，從而抑制惡性間皮瘤細(xì)胞的生長［14］。在胃癌中，癌基因miR-372可以通過抑制LATS2的表達從而抑制細(xì)胞的生長，促進細(xì)胞凋亡［15］。說明LATS2在抑制腫瘤細(xì)胞生長中起著重要的作用。本研究通過免疫組織化學(xué)及實時定量PCR發(fā)現(xiàn)LATS2在皮膚鱗癌組織中表達降低。敲除LATS2的表達后細(xì)胞的克隆形成能力增強，與抑制miR-31的作用相反，進一步證實LATS2是miR-31的靶基因。

總之，本研究在皮膚鱗癌中miR-31通過抑制LATS2的表達調(diào)控鱗癌的生長，發(fā)揮著癌基因的作用，可為皮膚鱗癌的分子治療提供更多的依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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