王菲菲,王先良*,劉芳盈,呂占祿,錢 巖,朋玲龍,3 (.中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準與風(fēng)險評估國家重點實驗室,北京 000；.淄博市疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所,山東 淄博 5506；3.安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生系,安徽 合肥 3003)

PM2.5是大氣顆粒物的主要組成部分和主要毒性組分,其主要來源于燃煤排放和汽車尾氣.目前我國的大氣污染雖然已從煤煙型轉(zhuǎn)向煤煙和燃油復(fù)合型,但燃煤污染產(chǎn)生的 PM2.5污染仍較為嚴重[1].山西某煤煙型污染城市大氣顆粒物污染源解析研究顯示,在燃煤、土壤、建材、交通、冶金和燃油 6種主要污染源中,燃煤源對大氣顆粒物的平均貢獻率最大,采暖期和非采暖期燃煤對 PM2.5的貢獻率分別為 35%～48%和 20%～42%[2].研究顯示,PM2.5可到達細支氣管及肺泡,通過肺部氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)釋放炎癥因子和細胞因子介導(dǎo)心血管事件,部分組分(如水溶性過渡金屬等)甚至可以穿過肺泡間質(zhì)進入血液循環(huán),直接影響心血管系統(tǒng)[2-4].研究顯示,PM2.5可到達細支氣管及肺泡,通過肺部氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)釋放炎癥因子和細胞因子介導(dǎo)心血管事件,部分組分(如水溶性過渡金屬等)甚至可以穿過肺泡間質(zhì)進入血液循環(huán),直接影響心血管系統(tǒng)[4].研究選擇大同散煤為樣煤采集細顆粒物,以人臍靜脈內(nèi)皮細胞 EA.hy926為研究對象,采用超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及丙二醛(MDA)指標檢測 PM2.5不同組分對 EA.hy926細胞氧化損傷程度的影響,以期為探尋PM2.5對心血管細胞毒性的優(yōu)勢組分及進一步探討燃煤PM2.5對心血管毒性機制提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗細胞 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株EA.hy926購自美國ATCC細胞庫,增殖周期約為31h.

1.1.2 儀器 PM2.5撞擊式中流量顆粒物采樣器(78L/min),生物安全柜(美國Thermo Forma公司),CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國 Thermo Forma公司),倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司,TH4-200),自動蒸汽滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司, D-1).

1.1.3 試劑 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(南京建成生物工程研究所).

1.2 方法

1.2.1 燃煤 PM2.5的采集 以大同散煤為樣煤,采用PM2.5撞擊式中流量顆粒物采樣器(78L/min)和直徑90mm的石英纖維濾膜,利用固定源稀釋通道對燃煤排放細顆粒物進行直接采集,具體方法參照文獻[5].

1.2.2 燃煤 PM2.5全顆粒物、無機組分和有機組分的提取 全顆粒物提取采用超聲水浴法,無機組分提取采用超聲水浴提取后,0.22μm過濾法,有機組分提取采用于索氏提取器法,具體方法參照文獻[5].全顆粒物和無機組分用滅菌PBS配制成100,250,500,1000,2000μg/mL的染毒母液備用,有機組分用色譜純二甲基亞砜(DMSO)配制成100,250,500,1000,2000μg/mL的染毒母液備用.

1.2.3 血管內(nèi)皮細胞EA.hy926的培養(yǎng) 將凍存的EA.hy926細胞移入含20%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液中,在 37℃5%CO2條件下培養(yǎng)復(fù)蘇.具體方法見文獻[5].

1.2.4 細胞染毒和試驗分組 將燃煤 PM2.5全顆粒物、無機組分、有機組分染毒母液超聲震蕩15min,依據(jù) MTs法檢測燃煤 PM2.5不同組分對EA.hy926細胞毒性影響數(shù)據(jù),加入含0.5% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液 10倍稀釋,使終濃度為10,25,50,100,200μg/mL,全顆粒物和無機組分以PBS為溶劑對照,有機組分以DMSO為溶劑對照.臨用前超聲 15min,棄去培養(yǎng)板中原培養(yǎng)液,加入已配制好的終濃度染毒液,每個劑量設(shè)置 3個平行樣.

染毒 24h后,按照氧化損傷效應(yīng)指標測定試劑盒說明,取細胞上清液 1mL加入 EP管中,3000r/min,離心 15min,取上清用于氧化損傷試驗.

1.2.5 氧化損傷效應(yīng)指標測定 (1) SOD活力測定:按照試劑盒說明中的操作步驟加樣,混勻,室溫放置 10min,設(shè)置鎢燈,550nm 處,1cm 光徑,蒸餾水調(diào)零,比色測OD值.每mL反應(yīng)液中SOD抑制率達 50%時所對應(yīng)的 SOD量為一個 SOD活力單位(U).

(2) GSH-PX 測定:按照試劑盒說明中的操作步驟加樣,混勻,室溫靜置 15min后,412nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測OD值.規(guī)定每0.1mL細胞上清液在37℃反應(yīng)5min,扣除非酶促反應(yīng)的作用,使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位.

(3) MDA含量的測定:按照試劑盒說明中的操作步驟加樣,旋渦混勻器充分混勻.試管口用保鮮膜封口,并針刺一小孔,置95℃恒溫水浴40min.流水冷卻后,波長 532nm 處,1cm 光徑,蒸餾水調(diào)零,比色測OD值.

1.3 統(tǒng)計與分析

用 SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計處理,試驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示.多個樣本平均數(shù)的比較采用單因素方差分析,根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果,方差齊性時選擇 LSD法,方差不齊時選擇Tamhane’s T2 法,統(tǒng)計檢驗水準P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 燃煤 PM2.5各組份對 EA.hy926細胞 SOD含量的影響

燃煤PM2.5各組分對EA.hy926細胞染毒24h后,隨著染毒劑量的增加,細胞上清液中 SOD活力均下降,且與對照組之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01),存在劑量-反應(yīng)關(guān)系.具體結(jié)果分別為全顆粒物(26.45～19.03U/mL)、無機組分(26.45～15.5U/mL)、有機組分(20.15～9.37U/mL) (表 1).

相同劑量組比較,燃煤 PM2.5各組分抑制SOD活力能力依次為:有機組分＞無機組分＞全顆粒物,同劑量組不同組分間的比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)(表 1).

表1 燃煤細顆粒物不同組分染毒后細胞上清液中SOD的變化Table 1 SOD contents of the different components of coal-fired PM2.5on EA.hy926cells

2.2 燃煤PM2.5各組份對EA.hy926細胞GSHPX含量的影響

和溶劑對照相比,燃煤PM2.5全顆粒物、無機組分和有機組分分別對 EA.hy926細胞染毒后,隨著染毒劑量的增加,細胞上清液中GSH-Px活力 分 別 下 降 (71.16～17.68,71.16～13.05,65.13～13.47U/mL),除有機組分低濃度組(10,25μg/mL)外,各劑量組與溶劑對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05),具有一定的劑量依賴性(表2).

同劑量組染毒,燃煤 PM2.5各組分對細胞上清 GSH-Px活力的影響程度依次為:低濃度(10μg/mL)時,無機組分＞全顆粒物＞有機組分,隨著劑量增加,出現(xiàn)了無機組分＞有機組分＞全顆粒物.但相同劑量組染毒,全顆粒物和有機組分比較僅在25、100μg/mL劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異;和有機組分相比,全顆粒物和無機組分分別僅在10μg/mL劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05)(見表2).可見,燃煤PM2.5各組分引起GSH-Px活力下降程度基本具有無機組分＞有機組分＞全顆粒物的趨勢,但統(tǒng)計學(xué)意義不顯著.

表2 燃煤細顆粒物不同組分染毒后細胞上清液中GSH-PX的變化Table 2 GSH-PX contents of the different components of coal-fired PM2.5 on EA.hy926cells

2.3 燃煤PM2.5各組份對EA.hy926細胞MDA含量的影響

和溶劑對照相比,燃煤PM2.5全顆粒物、無機組分和有機組分分別對 EA.hy926細胞染毒后,隨著染毒劑量的增加,細胞上清液中 MDA含量分別有不同程度的增加(2.91～7.23,2.91～6.99,3.22～5.40U/mL).除無機組分低濃度組(10,25μg/mL)和溶劑對照相比無統(tǒng)計學(xué)差異外,其他不同組分各劑量組與溶劑對照組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01 或P＜0.05)(表 3) .

相同劑量組染毒,燃煤 PM2.5各組分對細胞上清 MDA的影響程度沒有一致性,低濃度(10,25,50μg/mL)時,有機組分＞全顆粒物＞無機組分,隨著劑量增加(100,200μg/mL),逐漸出現(xiàn)了全顆粒物＞無機組分＞有機組分的趨勢.相同劑量組全顆粒物和無機組分比較,分別在(10,25,50,100μg/mL)具有統(tǒng)計學(xué)差異,而在 200μg/mL 時無統(tǒng)計學(xué)意義;和有機組分比較,全顆粒物和無機組分分別在(25,100,200μg/mL)、(10,25,50,200μg/mL)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01或P＜0.05).特別注意的是,在 200μg/mL劑量組和有機組分比較,無機組分和全顆粒物 MDA增加明顯(P＜0.01)(表 3).可見,燃煤PM2.5各組分所致的MDA含量大小存在低劑量組有機組分＞全顆粒物＞無機組分,高劑量組全顆粒物＞無機組分＞有機組分趨勢,且具有統(tǒng)計學(xué)意義.從上述結(jié)果可以看出,隨著劑量增加,全顆粒物和無機組分引起 MDA含量明顯增加,而有機組分則變化趨于平緩.

表3 燃煤細顆粒物不同組分染毒后細胞上清液中MDA的變化Table 3 MDA contents of the different components of coal-fired PM2.5on EA.hy926cells

3 討論

氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡是決定細胞生存狀態(tài)的關(guān)鍵因素.正常機體內(nèi)有一套抗氧化防御系統(tǒng),來防止氧及其代謝產(chǎn)物對機體的損傷,包括清除自由基,如SOD、GSH-Px等;自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),氧化終產(chǎn)物為 MDA,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細胞毒性.MDA的測定常常與SOD和GSHPX的測定相互配合,MDA的高低間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度,而 SOD、CAT和GSH- PX活力的高低又反應(yīng)了機體清除氧自由基的能力,即機體抗氧化能力.

MDA含量常常可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,間接地反映出機體細胞受自由基損傷的嚴重程度.正常和沙塵天氣 PM2.5暴露于大鼠肺泡巨噬細胞,細胞內(nèi) MDA和胞質(zhì)游離 Ca2+含量升高,而谷胱甘肽(GSH)含量下降[6].油煙PM2.5有機成分對胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞 MDA影響隨著PM2.5染毒濃度的升高和染毒時間的延長而升高[7].PM2.5暴露對人體血液中MDA會產(chǎn)生影響,每增加 10μg/m3,血液中 MDA會增加3.7%,顯示PM2.5暴露能誘導(dǎo)外周血的氧化應(yīng)激[8].然而也有研究表明,PM2.5-10和 UFP導(dǎo)致了大鼠心臟中MDA增加1.5倍,而PM2.5暴露和心臟MDA變化無統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)論顯示慢性暴露于 PM2.5-10和 UFP會對心肌相關(guān)疾病基因表達(細胞色素P450和硫氧還蛋白)產(chǎn)生直接影響[9].顆粒物不同組分對MDA影響存在不一致性.有研究發(fā)現(xiàn)[10],城市PM不同組分使脂質(zhì)過氧化物MDA增加能力依次為:水溶組分＞有機提取物＞非水溶組分.而王偉等[11]測定 PM2.5對中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)氧化損傷時,PM2.5導(dǎo)致 MDA含量影響是:有機組分大于無機組分,但是尚不能認為氧化損傷指標間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.上述研究結(jié)果的劑量-反應(yīng)關(guān)系與實驗相一致,隨著劑量增加,燃煤PM2.53種組分均會導(dǎo)致MDA含量增加,且均有劑量依賴性.但在相同劑量組,不同組分對MDA 影響比較顯示:低濃度時,有機組分＞無機組分＞全顆粒物,隨著劑量增加,逐漸出現(xiàn)了全顆粒物＞無機組分＞有機組分,而且無機組分在較高劑量時增加明顯,且均差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.從上述結(jié)果可以看出,隨著劑量增加,全顆粒物和無機組分引起MDA含量明顯增加,而有機組分變化趨于平緩.這與他人研究結(jié)果存在差異,推測可能是PM2.5來源及組分不同所致.相比大氣 PM2.5,燃煤細顆粒物含有更多的痕量重金屬成分(如As、Ni、V、Se、Cd、Pb、Cr等)和有機組分等[12],能夠刺激肺泡巨噬細胞產(chǎn)生自由基,對組織細胞造成進一步損傷,如脂質(zhì)過氧化、膜上受體與酶類滅活、蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷和誘導(dǎo)細胞凋亡.

SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶,是人體內(nèi)重要的抗氧化酶.人體內(nèi)有兩種 SOD,一種是CuZn-SOD,另一種是Mn-SOD,兩者之和為T-SOD.本實驗檢測了 T-SOD.SOD是生物體內(nèi)清除自由基(如超氧陰離子自由基等)的首要物質(zhì),活力越高表示清除自由基和抗氧化能力越強.GUTIéRREZ-CASTILLO M E 等人[10]發(fā)現(xiàn),城市PM不同組分暴露可導(dǎo)致SOD活力降低的影響程度為:水溶組分＞有機提取物＞非水溶組分.王偉等[11]在測定 PM2.5對中國倉鼠肺成纖維細胞(CHL)氧化損傷時,PM2.5導(dǎo)致SOD活力影響是:有機＞無機,但是尚不能認為氧化損傷指標間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.油煙 PM2.5有機組分能導(dǎo)致胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞 SOD活力隨著 PM2.5染毒濃度的升高和染毒時間的延長而降低[7].但動物實驗研究[13]發(fā)現(xiàn),隨著 PM2.5濃度增大,正常、沙塵暴天氣 PM2.5均可引起大鼠肺、肝臟SOD酶活性逐漸降低,而心臟 SOD酶活性無顯著性變化.大氣PM2.5可誘導(dǎo)HUVECs的SOD活性呈劑量依賴性下降,其中相同劑量組染毒,水溶組分比有機組分對SOD活性抑制更強.燃燒源顆粒物排放會降低冠狀動脈病人SOD及增加炎癥反應(yīng)和血小板活化[14].本研究結(jié)果顯示:和對照相比,隨著劑量增加,燃煤 PM2.53種組分對 SOD活性降低,且均有劑量依賴性,這與以上研究結(jié)論一致,但相同劑量組染毒,不同組分對 SOD 活性影響為有機組分＞無機組分＞全顆粒物(P＜0.01).該結(jié)果與本實驗MTS細胞毒性試驗研究結(jié)果一致,但與以上其他人的研究結(jié)果有差別,推測可能是由于采用不同源 PM2.5,其化學(xué)組成和攜帶的痕量重金屬差異所致,大同市采暖期顆粒物中BaP、PAHs等有機組分及金屬元素均大于非采暖期[15],且秋季大氣中 Ni、Cu、Zn、As、Se、Br、Pb等在細粒子中富集程度較高,主要來源于燃煤塵、土壤塵和工業(yè)源[16].另一方面本研究測的是細胞上清中的總SOD活力,而以上研究測的是細胞線粒體內(nèi)SOD活力.

GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶,硒是GSH-Px酶系的組成成分,它能催化GSH變?yōu)镚SSG,使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,同時促進 H2O2的分解,從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害.GSH-Px的生理功能主要是催化GSH參與過氧化反應(yīng),清除在細胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基,從而減輕細胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用.GSH是一種低分子清除劑,GSH-Px 活力和GSH量的多少可衡量機體抗氧化能力.孟紫強等[13]研究發(fā)現(xiàn),隨著 PM2.5濃度增大,正常天氣和沙塵PM2.5使大鼠肺臟GSH含量呈劑量依賴性降低,使肝臟GSH含量出現(xiàn)先升高后降低的非線性變化特征,而心臟GSH含量無顯著性變化.正常天氣 PM2.5比沙塵暴 PM2.5對肺、肝臟GSH含量的影響較大,但同劑量2種來源PM2.5對3種臟器GSH酶活性的影響均無顯著性差異.油煙 PM2.5有機組分能導(dǎo)致胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞GSH活力隨著PM2.5染毒濃度的升高而降低,并未存在時間劑量關(guān)系[7].本實驗結(jié)果顯示:各組分的 GSH-Px雖然隨著燃煤 PM2.5濃度增加逐漸降低,存在劑量反應(yīng)關(guān)系,這與以上研究的結(jié)果具有一致性,但同劑量染毒,低濃度

(10μg/mL)時,無機組分＞全顆粒物＞有機組分,隨著劑量增加,出現(xiàn)了無機組分＞有機組分＞全顆粒物,不同組分之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,尚不能認為不同組分對GSH-Px活力影響有差別.

4 結(jié)論

4.1 燃煤 PM2.5各組分對 EA.hy926細胞染毒24h后,隨著染毒劑量的增加,細胞上清液中SOD活力均下降,與對照組相比差異顯著,而相同劑量組比較,其抑制SOD活力能力依次為:有機組分＞無機組分＞全顆粒物,且相同劑量組不同組分間的比較均有統(tǒng)計學(xué)差異.

4.2 燃煤 PM2.5各組分對 EA.hy926細胞染毒24h后,隨著染毒劑量的增加,GSH-Px活力均下降,具有劑量依賴性,引起GSH-Px活力下降程度基本具有無機組分＞有機組分＞全顆粒物的趨勢,但統(tǒng)計學(xué)意義不顯著.

4.3 和溶劑對照相比,燃煤 PM2.5全顆粒物、無機組分和有機組分分別對EA.hy926細胞染毒后,隨著染毒劑量的增加,MDA含量分別有不同程度的增加,各組分所致的 MDA含量大小存在低劑量組有機組分＞全顆粒物＞無機組分,高劑量組全顆粒物＞無機組分＞有機組分趨勢,隨著劑量增加,全顆粒物和無機組分引起 MDA含量明顯增加,而有機組分則變化趨于平緩.

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