馬棟山,熊 薇,張瓊瓊,郭羿宏,趙文吉,郭逍宇* (1.首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院,北京100048；2.北京市城市環(huán)境過(guò)程與數(shù)字模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,北京 100048)

T-RFLP分析較DGGE、SSCP或ARDRA等方法具有分析精細(xì)、分析能力強(qiáng)、易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì),另外通過(guò)ABI自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)任何一末端限制性片段的測(cè)序結(jié)果均可與 Internet數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.cme.msu.edu)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析[1].已有學(xué)者成功應(yīng)用T-RFLP技術(shù)進(jìn)行菌種的鑒定、濕地、農(nóng)田、水體等多生態(tài)環(huán)境中微生物群落多樣性及其動(dòng)態(tài)變化研究[2].但對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行T-RFLP分析時(shí),可產(chǎn)生大量的酶切片段,其中 80%～90%的酶切片段(T-RFs)屬于非培養(yǎng)片段或數(shù)據(jù)庫(kù)信息不全而無(wú)法比對(duì)到種屬特征,因而無(wú)法對(duì)該片段進(jìn)行深入分析.多元統(tǒng)計(jì)特征分析因其在海量數(shù)據(jù)中挖掘數(shù)據(jù)的內(nèi)在規(guī)律方面有較大的優(yōu)勢(shì),因而得到了人們的重視.已有學(xué)者初步嘗試借用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)T-RFLP分析中酶切片段進(jìn)行分析[3].

再生水作為北京市穩(wěn)定的第二新型水源,在維持河湖景觀、恢復(fù)河湖生態(tài)等方面發(fā)揮了重要作用,而再生水水質(zhì)特性決定了其城市河湖景觀補(bǔ)水存在多種負(fù)面生態(tài)環(huán)境效應(yīng)[4].以氨氮為河道水體富營(yíng)養(yǎng)化主控因素的再生水補(bǔ)水河湖濕地水污染防治成為濕地研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[5].人工濕地具有低投資、低能耗、低處理成本和脫氮除磷功能,是目前再生水廠河湖景觀補(bǔ)水之前普遍采用的水質(zhì)凈化方式.濕地再生水處理機(jī)理不僅體現(xiàn)在植物通過(guò)吸收作用去除氮、磷等污染物,更體現(xiàn)在植物通過(guò)根際分泌物影響系統(tǒng)中微生物特性進(jìn)而影響系統(tǒng)處理效果[6].濕地植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)與功能隨濕地植物種類、季節(jié)及濕地類型等因素的變化而變化[7],濕地補(bǔ)水水源水質(zhì)的好壞同樣影響植物根際微生物功能和生物過(guò)程[8].大量文獻(xiàn)分析了氨氧化細(xì)菌在水體、底泥、農(nóng)田等諸多環(huán)境中群落結(jié)構(gòu)及其多樣性特性[9-10].但對(duì)水生植物根際氨氧化細(xì)菌群落組成及多樣性的研究尚不多見.基于此本文擬借助于因子分析(FA)、去除勢(shì)典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法,結(jié)合T-RFLP技術(shù)產(chǎn)生的大量T-RFs片段構(gòu)建的多樣性指數(shù)和PAT比對(duì)結(jié)果等常規(guī)分析方法對(duì)王平濕地再生水補(bǔ)水口、遠(yuǎn)離補(bǔ)水口香蒲根際細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌群落多樣性及其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行對(duì)比研究,為再生水補(bǔ)水濕地植物根際微生物群落凈化機(jī)理提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

王平濕地(39°58.580′E,115°58.930′N)西起王平溝口,東至南澗溝口,全長(zhǎng) 1050m,屬門頭溝永定河段.王平濕地系統(tǒng)內(nèi)水生植物主要包括香蒲、蘆葦、浮萍等,其中,香蒲的覆蓋度可達(dá)70%～90%.采樣點(diǎn)位于門頭溝王平村左岸附近.再生水主要來(lái)源于王坪村電廠和周邊的居民生活區(qū),再生水排放量約為0.9萬(wàn)t/a.

1.2 樣品采集及理化指標(biāo)分析

圖1 北京市王平濕地采樣點(diǎn)分布示意Fig.1 Distribution of sampling sites in Wangping Wetland in Beijing

選取王平濕地不同處理區(qū)植物香蒲為研究對(duì)象,分別取河流濕地再生水補(bǔ)水口的上游點(diǎn)位L1(補(bǔ)水口上游 200m),再生水補(bǔ)水口 L2以及補(bǔ)水口下游300m處的L3;人工濕地再生水補(bǔ)水口位點(diǎn) L4(距離 L2位點(diǎn) 1000m)(圖 1).采樣時(shí)間2012年9月,去除植物根系上的動(dòng)植物殘骸及石塊等非底質(zhì)雜物,收集附著在根系上的底泥作為樣本.每個(gè)點(diǎn)位設(shè)5個(gè)平行.采集的樣品裝在干凈密封的聚四氟乙烯塑料袋中,

于 4℃下保存并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室,每個(gè)位點(diǎn)的 5個(gè)平行樣等量混合后最終成為一個(gè)樣點(diǎn),共計(jì)四個(gè)樣點(diǎn),分別記為 L1、L2、L3、L4[11].樣品分兩部分處理:一部分進(jìn)行理化指標(biāo)分析,總氮(TN)采用凱氏定氮法,總磷(TP)采用堿熔—鉬銻抗分光光度法,總有機(jī)碳(TOC)采用重鉻酸鉀氧化—分光光度法測(cè)定,銨態(tài)氮采用2mol/L KCl浸提—靛酚藍(lán)比色法測(cè),氧化還原電位采用ORP儀直接測(cè)量,重金屬采用原子吸收光譜法,具體測(cè)定結(jié)果見表 1.剩余根際土壤樣品于-20℃下保存,用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析.

1.3 基于T-RFLP的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.3.1 DNA提取 采用土壤樣品提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取根際樣品總DNA,操作步驟按照使用說(shuō)明書進(jìn)行.提取總DNA經(jīng) 0.8%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定,提取的DNA放置于-20℃條件下保存?zhèn)溆?

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR技術(shù)采用史青應(yīng)用T-RFLP 技術(shù)分析滇池污染水體的細(xì)菌群落技術(shù)[12]進(jìn)行擴(kuò)增.

表1 不同樣點(diǎn)香蒲根際土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of cattail rhizospheric soil in different plots

1.3.3 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)分析 分別采用MspⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ對(duì)熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切.在 37℃下放置 3～5h.然后在 65℃條件下溫浴15min使酶失活.隨后將酶切產(chǎn)物送至天根生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因掃描(GeneScan),得到T-RFLP圖譜.

1.3.4 氨氧化細(xì)菌克隆文庫(kù)的建立和測(cè)序 采用王亞男等[13]的直接法克隆和測(cè)序分析,取總DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Peak Scanner進(jìn)行分析.舍去小于50bp和大于500bp的片段.對(duì)于細(xì)菌,由于相對(duì)數(shù)量過(guò)小的限制性末端片段(T-RFs)不會(huì)對(duì)群落的特性產(chǎn)生明顯的影響[14-16],故在本分析中舍去了相對(duì)數(shù)量<1%的 T-RFs,然后分別計(jì)算圖譜中每一個(gè)峰的峰面積與所有峰總面積的比值,將每個(gè) T-RF所占的百分比作為權(quán)重導(dǎo)入Primer軟件,聚類方法選擇組間平均距離法,距離選擇平方歐氏距離,做出聚類分析圖.綜合采用 Peak Scanner、CanoDraw for Windows、primer和 Excel2007 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出聚類圖、優(yōu)勢(shì)菌種、多樣性指數(shù)以及CCA排序.

2 結(jié)果與討論

2.1 基于T-RFLP譜圖的聚類分析

把采集樣品基于 T-RFLP微生物群落結(jié)構(gòu)分析的譜圖進(jìn)行預(yù)處理之后,采用Primer分析結(jié)果如圖2(a)所示.以相似性50%為標(biāo)準(zhǔn),可以將細(xì)菌各樣點(diǎn)分為三類:細(xì)菌類群 BⅠ由位于再生水補(bǔ)水口上游位置的L1樣點(diǎn)組成,類群BⅡ由再生水補(bǔ)水口L2與L4樣點(diǎn)組成,類群BⅢ是位于再生水補(bǔ)水口下游位置L3樣點(diǎn)構(gòu)成;如圖2(b)所示,以相似性 32%為標(biāo)準(zhǔn),可以將氨氧化細(xì)菌各樣點(diǎn)分為兩類:氨氧化細(xì)菌類群AOBⅠ包含遠(yuǎn)離再生水補(bǔ)水口L1和L3樣點(diǎn);氨氧化細(xì)菌類群AOBⅡ則包含再生水補(bǔ)水口L2和L4兩樣點(diǎn).

從聚類結(jié)果可知,細(xì)菌類群以受再生水干擾程度的強(qiáng)弱而進(jìn)行分群并類,不同濕地類型 L2與L4因受再生水補(bǔ)水口水質(zhì)影響同樣歸并為一類.與氨氧化細(xì)菌群落的分類結(jié)果相比,細(xì)菌群落對(duì)環(huán)境條件的變化較氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為敏感,可能與氨氧化細(xì)菌群落主要由環(huán)境條件中不同形態(tài)氮素濃度梯度決定,細(xì)菌群落變異可能是環(huán)境條件變異的綜合反應(yīng)[17].

圖2 各樣點(diǎn)細(xì)菌群落和氨氧化細(xì)菌的等級(jí)聚類分析Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of the bacterial and AOB from different sampling plots

2.2 再生水補(bǔ)水對(duì)不同樣點(diǎn)細(xì)菌和 AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

酶切圖譜和多樣性指數(shù)結(jié)果均顯示,MspI酶切樣品微生物多樣性略高于HhaⅠ、HaeⅢ酶切,故后續(xù)分析采用MspI酶切結(jié)果[18].以MspⅠ為酶切的不同類群香蒲根際細(xì)菌和AOB群落多樣性指數(shù)見表 2.細(xì)菌各類群多樣性指數(shù)均隨再生水干擾強(qiáng)度的增加依次表現(xiàn) BⅠ>BⅢ>BⅡ的變化趨勢(shì),而氨氧化細(xì)菌群落則與細(xì)菌群落呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì),即再生水補(bǔ)水口氨氧化細(xì)菌各群落多樣性指數(shù)均明顯高于遠(yuǎn)離補(bǔ)水口氨氧化細(xì)菌群落.再生水補(bǔ)水不僅降低了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中物種的豐富度,同時(shí)為應(yīng)對(duì)再生水中豐富氮磷等水質(zhì)特性,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中與再生水水質(zhì)特性密切聯(lián)系的優(yōu)勢(shì)類群在群落結(jié)構(gòu)中占有主導(dǎo)優(yōu)勢(shì),群落均勻度降低,進(jìn)而群落綜合多樣性指數(shù)降低.對(duì)于 AOB而言,再生水中高濃度氮含量是導(dǎo)致再生水補(bǔ)水口氨氧化細(xì)菌群落各多樣性指數(shù)顯著升高的直接原因[20].

2.3 再生水補(bǔ)水對(duì)不同樣點(diǎn)細(xì)菌和 AOB群落結(jié)構(gòu)的影響

以MspⅠ酶切結(jié)果計(jì)算各類群中 T-RFs片段的豐度,T-RFs片段豐度值>4%的類型為優(yōu)勢(shì)菌群[20],而片段豐度值<1%的類型為偶見菌群,其余為非優(yōu)勢(shì)菌群[21],以MspⅠ為酶切的香蒲根際細(xì)菌和AOB群落結(jié)構(gòu)的空間差異見表3.隨再生水干擾強(qiáng)度增強(qiáng)細(xì)菌類群 T-RFs片段數(shù)呈明顯降低趨勢(shì);細(xì)菌類群 BⅠ因其較高豐度的非優(yōu)勢(shì)菌群和偶見菌群,從而群落均勻度較高,而細(xì)菌類群 BⅡ則因較低豐度的非優(yōu)勢(shì)菌群及不具偶見菌群從而群落均勻度較低;遠(yuǎn)離再生水補(bǔ)水口氨氧化細(xì)菌群落AOBⅠ較補(bǔ)水口AOBⅡ具較少的T-RFs片段數(shù),且其優(yōu)勢(shì)氨氧化菌群相對(duì)豐度值遠(yuǎn)高于AOBⅡ,表明在再生水作用下氨氧化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)片段數(shù)量的增加、非優(yōu)勢(shì)片段數(shù)量的減少和偶見片段數(shù)量的消失是導(dǎo)致 AOBⅠ群落豐富度和均勻度降低的主要原因.

表2 以MspⅠ為酶切的不同類群香蒲根際細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indexes of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB community in different groups with Msp I enzyme

2.4 基于傳統(tǒng)T-RFs片段與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合分析

2.4.1 MiCA 比對(duì)結(jié)果 將HaeⅢ、MspⅠ、Hha3Ⅰ種內(nèi)切酶消化的T-RFLP圖譜屬性數(shù)據(jù)上傳到 Phylogenetic Assignment Tool(PAT,https://secure.limnology.wisc.edu/trflp/newuser.jsp)網(wǎng)站[22-23],并結(jié)合 MiCA (http:// MiC A.ibest.uidaho.edu/pat.php通過(guò) Virtual Digest(ISPaR)模塊產(chǎn)生的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)起主要作用T-RFs類型的系統(tǒng)發(fā)育分類進(jìn)行推測(cè).之后通過(guò)計(jì)算其細(xì)菌 T-RFs比例,以占據(jù)整個(gè) T-RFs的4%以上為優(yōu)勢(shì)菌種;而 AOB通過(guò)電子酶切(MspⅠ、HhaI、Hae)Ⅲ得出的片段和克隆得出的片段相比對(duì),比對(duì)可能種屬見表4.

表3 MspⅠ酶切細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)空間差異Table 3 The spatial differences of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB community structures with Msp I enzyme

表4 MspI酶切香蒲根際細(xì)菌和AOB類群可能種屬Table 4 The corresponding species and features of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities with Msp I enzyme

2.4.2 因子分析 以基于細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌群落MspⅠ酶切,結(jié)果顯示細(xì)菌群落篩選出的73個(gè)T-RFs片段反應(yīng)的信息累計(jì)方差達(dá)到 92.3%,而氨氧化細(xì)菌群落篩選出的56個(gè)T-RFs片段反應(yīng)的信息累計(jì)方差達(dá)到 95.4%,表明兩個(gè)原始數(shù)據(jù)矩陣均可以較好地反應(yīng)基于片段的源解析[24],統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5.細(xì)菌群落因子分析將73個(gè)T-RFs片段降為三個(gè)維度,其中 PCA1提取了 33個(gè)T-RFs片段,除81bp片段之外,其余32個(gè)非培養(yǎng)或數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)匹配.根據(jù)因子分析原理可比對(duì)的81bp片段可能與不可比對(duì)的32個(gè)T-RFs片段具有共同或相近的源,即81bp片段可能與不可比對(duì)的32個(gè)T-RFs片段共同受水質(zhì)生境特征中某一相同環(huán)境因子的制約和影響,或與水質(zhì)生境特征中某一環(huán)境因子的生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程具有密切的關(guān)系.同樣 PCA2和 PCA3中提取27個(gè)和11個(gè)非培養(yǎng)或數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)匹配的 T-RFs片段可能與其對(duì)應(yīng)維度中可比對(duì)的150bp和138bp片段具有共同或相近的源.基于氨氧化細(xì)菌群落的因子分析將56個(gè)T-RFs片段降為兩個(gè)維度,對(duì)于氨氧化細(xì)菌群落中PCA4中提取的39個(gè)T-RFs片段可能與Nitrosospirasp.具有共同或相近的源,而PCA5代表的 17個(gè) T-RFs片段可能與是Nitrosomonassp.共同或相近的源.

2.4.3 典范對(duì)應(yīng)分析 為驗(yàn)證基于MiCA比對(duì)結(jié)合因子分析結(jié)果見圖3.排序結(jié)果表明CCA排序圖第一軸AX1和第二軸AX2的特征值累計(jì)占總特征值的 71.23%,排序圖包含了大部分的信息,排序效果良好.對(duì)于細(xì)菌群落而言,再生水補(bǔ)水口樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4在排序圖中具有共同的分布格局與范圍,同時(shí)與樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4具共同分布格局的T-RFs片段主要包括了以150bp為代表的PCA2中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4所代表的BⅡ群落總豐度的55.6%.環(huán)境因子中TOC與樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4具有共同分布格局與范圍的結(jié)果則進(jìn)一步證明再生水補(bǔ)水口以 150bp為代表的占群落總豐度55.6%菌群均與水中TOC的生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程具有密切關(guān)系. 而且過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn) 150bp片段對(duì)應(yīng)的種屬為鞘氨醇單胞菌屬,Onruthai研究表明鞘氨醇單胞菌是環(huán)境中比較獨(dú)特的一類降解菌,它們的降解范圍非常寬,從單環(huán)、多環(huán)芳烴到其它有機(jī)污染物都可以作為它們生長(zhǎng)的碳源[25].PCA2是通過(guò)聚類而得,表明在PCA2類群當(dāng)中,除去不能確定的非培養(yǎng)的細(xì)菌類群外,很有可能其余的片段大部分與碳循環(huán)是相關(guān)的.

表5 以MspI為酶切的香蒲根際細(xì)菌和AOB類群的PCA聚類片段和比例Fig.5 Clustering fragments and proportion of cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities with Msp I enzyme

左圖:細(xì)菌a:61,68,80,81,86,88,89,91,111,120,141,143,144,157,159,160,167,187,193,205,261,274,276,277,473,492,494,497 b:76,85,87,92,124,128,135,145,155,162,165,175,183,204,286,425,451,466,467,469,485,486,487,488,496右圖:AOB a:70,71,78,85,86,92,192,193,195,205,232,259,263,492 b:52,57,63,69,74,83,104,119,142,151,160,174,219,225,234,237,264,265, 491

圖3 以MspI為酶切的香蒲根際細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌樣方、物種與環(huán)境因子的典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)Fig.3 Canonical correspondence analysis biplot of the cattail rhizospheric soils bacterial and AOB communities in relation to the species and environmental factors

再生水補(bǔ)水口上游樣點(diǎn) 1在排序圖中的T-RFs片段主要包括了以81bp為代表的PCA1中所有bp片段,它們的相對(duì)豐度和占到整個(gè)BⅡ群落總豐度的 75.5%.環(huán)境因子中 TN、TP和銨態(tài)氮與樣點(diǎn) 1具有共同分布格局的結(jié)果則進(jìn)一步證明再生水補(bǔ)水口上游以81bp為代表的菌群與水質(zhì)生境特征中TN、TP和銨態(tài)氮的生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程具有密切關(guān)系. 經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn) 81bp對(duì)應(yīng)的是假單胞菌屬和Geitlerinemasp.屬.假單胞菌屬是一種在有機(jī)污染中普遍存在的菌屬,可以利用包括單碳在內(nèi)的許多有機(jī)物作為自身的能量和碳源,以有機(jī)氮或無(wú)機(jī)氮為氮源進(jìn)行化能營(yíng)養(yǎng)生活[26],而Geitlerinemasp.是專性屬于底棲生物環(huán)境,與水環(huán)境中氮的循環(huán)具有密切關(guān)系已得到普遍的認(rèn)同[27],這與 CCA分析的結(jié)果中與環(huán)境因子氮循環(huán)具有密切關(guān)系的結(jié)果保持一致.再生水補(bǔ)水口下游樣點(diǎn)3在排序圖中的T-RFs片段主要包括了以 138bp為代表的 PCA3中所有bp片段數(shù),它們的相對(duì)豐度和到整個(gè)BⅢ群落總豐度的68.7%.環(huán)境因子重金屬Cu、V和Ti與樣點(diǎn) 3具有共同分布格局與范圍的結(jié)果則進(jìn)一步證明再生水補(bǔ)水口以 138bp為代表的相似菌群均與水質(zhì)生境特征重金屬Cu、V和Ti具有密切關(guān)系.

對(duì)于AOB而言,與樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4具共同分布格局的T-RFs片段主要包括了以266bp為代表的PCA5中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點(diǎn) 2和樣點(diǎn) 4所代表的 AOBⅡ群落總豐度的65.5%.環(huán)境因子中NH3-N與樣點(diǎn)2和樣點(diǎn)4具有共同分布格局的結(jié)果進(jìn)一步證明再生水補(bǔ)水口以 266bp代表的亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonassp.)受到再生水銨態(tài)氮的影響較大.以58bp為代表的PCA4中所有T-RFs片段,這些片段占到樣點(diǎn)1和樣點(diǎn)3所代表的AOBⅠ群落總豐度的97.6%.環(huán)境因子中TOC與樣點(diǎn)1和樣點(diǎn) 3具有共同分布格局與范圍的結(jié)果則進(jìn)一步證明再生水補(bǔ)水口以58bp為代表的亞硝化螺菌屬菌(Nitrosospirasp.)受到銨態(tài)氮的影響較小.AOBⅡ中包含兩個(gè)再生水補(bǔ)水口的銨態(tài)氮的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AOB,Ⅰ AOBⅡ中數(shù)量豐度最多的亞硝化單胞菌屬是在富含氨氮環(huán)境中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),而偏好相對(duì)低氨環(huán)境的亞硝化螺菌屬則數(shù)量極少.

3 結(jié)論

3.1 細(xì)菌類群以受再生水干擾程度的強(qiáng)弱而進(jìn)行分群并類,不同濕地類型因受再生水補(bǔ)水口水質(zhì)影響歸并為一類.

3.2 再生水補(bǔ)水口細(xì)菌群落以有機(jī)碳循環(huán)為主,補(bǔ)水口上游主要以氮循環(huán)為主,遠(yuǎn)離補(bǔ)水口細(xì)菌類群主要體現(xiàn)重金屬的生物化學(xué)循環(huán).

3.3 266bp為代表的Nitrosomonassp.具相似功能的菌群適合在高氨環(huán)境中生長(zhǎng);58bp所代表的

Nitrosospirasp.具相似功能特性的菌群適合在相對(duì)低氨環(huán)境中生長(zhǎng).

[1]Maidak B L, Cole J B, Lilburn T G. The RDP Ribosomal Data-base Project continues [J]. Nucleic Acids Res., 2000,28:173-174.

[2]Siripong Slil, Rittmann Bruce E. Diversity study of nitrifying bacteria in full-scale municipal wastewater treatment plants [J].Water Research, 2007,41(5):1110?1120.

[3]Tao Ding, Michael W Palmer and Ulrich Melcher Community terminal restriction fragment length polymorphisms reveal insights into the diversity and dynamics of leaf entophytic bacteria BMC [J]. Microbiology, 2013,13:1-11.

[4]孟慶義,吳曉輝,趙立新,等.再生水回用于北京景觀水體引起的水質(zhì)變化及其改善措施 [J]. 水資源保護(hù), 2011,27(1):51-54.

[5]曾 薇,李 磊,楊瑩瑩,等.A2O 工藝處理生活污水短程硝化反硝化的研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2010,30(5):625-632.

[6]Grove J K, Ste in O R. Polar Organic Solvent Rem oval in Microcosm Constructed Wet lands [J]. Water Research, 2005,39:4040-4050.

[7]McBride M B. Environmental Chemistry in Soils [M]. Oxford:Oxford University. Press, 1994:406-407.

[8]陳衛(wèi)平,張煒鈴,潘 能,等.再生水灌溉利用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究進(jìn)展 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2012,33(12):4070-4080.

[9]Teske A, Alm E, Regan J, et al. Evolutionary relationships among Ammonia and nitrite deoxidizing bacteria. [J]. Bacterial, 1994,176:6623-6630.

[10]Bock E, Koops H P. The genus nitrobacteria and related genera;Oxidation of inorganic nitrogen compounds as energy source;The prokaryotes: A handbook on the biology of bacteria.Ecophysiology, isolation, identification, applications [M]. New York: Springer-Verlag, 1992.

[11]王 薇,俞 燕,王世和.人工濕地污水處理工藝與設(shè)計(jì) [J]. 城市環(huán)境與城市生態(tài), 2001,14(1):59-62.

[12]史 青,柏耀輝,李宗遜,等.應(yīng)用 T-RFLP技術(shù)分析滇池污染水體的細(xì)菌群落 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2011,32(6):1788-1792.

[13]王亞男,曾希柏,俄勝哲,等.施肥對(duì)設(shè)施菜地氨氧化細(xì)菌群落和豐度的影響 [J]農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2012,31(12):2425-2432.

[14]Liu W T, Marsh T L, Cheng H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA [J].Canadian Metallurgical Quarterly, 1997,63(11):4516-4522.

[15]Mayrand P E, Corcoran K P, Ziegle J S, et al. The use of fluorescence detection and internal lane standards to size PCR products automatically [J]. Applied and Theoretical Electrophoresis, 1992,3(1):1-11.

[16]Ziegle J S, Su Ying, Corcoran K P, et al.Application of automated DNA sizing technology for genotyping microsatellite loci [J].Genomics, 1992,14(4):1026-1031.

[17]Horswill A R, Stoodley P, Stewart P S, et al. The effect of the cheMiCAl, biological, and physical environment on quorum sensing in structured microbial communities [J]. Anal. Bioanal.Chem., 2007,387:371–380.

[18]牟文婷,張 濤,孫 建,等.新疆特殊生境巖石內(nèi)生細(xì)菌末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)分析 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2012,52(3):381-388.

[19]Daims H, Nielsen P H, Nielsen J, et al. Novel Nitrospira-like bacteria as dominant nitrite-oxidizers in biof i lms from wastewater treatment plants: diversity and in situ physiology [J].Water Sci. Technol., 2000,41(4/5):85–90.

[20]Ringelberg D B, Foley K L, Reynolds C M. Electrogenic capacity and community composition of anodic biofilms in soil-based bioelectroche MiCAl systems [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011,90(5):1805-1815.

[21]Zhang Rui, Thiyagarajan Ve, Qian Pei-Yuan. Evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism analysis in contrasting marine environments [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2008,65(1):169–178.

[22]Sch ü tte Ursel M E, Abdo Z, Bent St J,et al. Advances in the use of terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)analysis of 16S rRNA genes to characterize microbial communities [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008,80(3):365-380.

[23]Kent Angela D, Smith Dan J, Benson Barbara J, et al. Web-based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(11):6768-6776.

[24]李惠民.水稻土細(xì)菌和氨氧化細(xì)菌的 RFLP分析 [D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2009.

[25]Pinyakong On, Habe H, Yoshida T, et al. Identification of three novel salicylate 1-hydroxylases involved in the phenanthrene degradation ofSphingobiumsp. strain P2 [J]. Biotechnology Research Center, 2003,301(2):350-357.

[26]Moore E R B, Tindall B J,V A P, Martins,et al. Palleroni.No-nmedical: Pseudomonas [J]. The Prokaryotes, 2006,6:646-703.

[27]Eric H Andrianasolo1, Douglas Goeger, William H, et al.Mitsoamide: A cytotoxic linear lipopeptide from the Madagas-car marine cyanobacteriumGeitlerinemasp.[J]. Pure and Applied Chemistry, 2007,79(4):593-602.