周 敏，章 薇*，李成文，陳 成，李 里，潘 江（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 40007）

·基礎(chǔ)研究·

簡(jiǎn)易冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作大鼠心肌梗死模型方法的探討

周 敏1，章 薇2*，李成文1，陳 成2，李 里2，潘 江2
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

目的 探討大鼠心肌梗死模型簡(jiǎn)易構(gòu)建的方法。方法 將大鼠麻醉，氣管插管連接呼吸機(jī)后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制作心肌梗死模型，于術(shù)后7 d處死，取出心臟觀察心臟外形，TTC染色后觀察心梗范圍。結(jié)果 85只大鼠用于心肌梗死模型的制作，存活80只，根據(jù)術(shù)中所見(jiàn)、心電圖及術(shù)后TTC等檢測(cè)確定有心肌梗死。結(jié)論 該方法制作大鼠心肌梗死模型的方法簡(jiǎn)易，且存活率較高，降低了大鼠冠脈結(jié)扎后的死亡率，為心肌梗死的基礎(chǔ)研究提供了另一種簡(jiǎn)易的模型制作方法。

心肌梗死；大鼠模型；心電圖；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎

近年來(lái)，冠心病嚴(yán)重威脅人類健康，已占我國(guó)心血管病總發(fā)病數(shù)的65%[1]，并呈現(xiàn)逐年上升且低齡化趨勢(shì)[2]。據(jù)WHO預(yù)測(cè)，到2030年冠心病將成為威脅人類健康的第二大疾病[3]。標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。當(dāng)前，心肌梗死模型的制作方法很多[4]，如冠脈結(jié)扎法、冠脈夾閉法、微量直流電刺激法、藥物注射法、冷凍法、電凝法等，但冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法為目前認(rèn)為最貼近心肌梗死生理狀態(tài)的方法。但傳統(tǒng)的冠脈結(jié)扎法存活率較低，從而加大了實(shí)驗(yàn)的難度，本實(shí)驗(yàn)采用一種簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)方法，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作，提高造模動(dòng)物存活率，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠85只，雄性，體質(zhì)量為（220± 10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào):43004700005441，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào): SCXK(湘):2013-004。

1.1.2 主要試劑與試藥 紅四氮唑 （TTC）（北京福星化工廠）；多聚甲醛、水合氯醛（長(zhǎng)沙唯爾生物科技有限公司生物試劑經(jīng)營(yíng)部）；硫酸阿托品注射液（河南淘弘制藥股份有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）。

1.1.3 主要儀器 小動(dòng)物呼吸機(jī)RWD407（深圳市瑞沃生命科技有限公司）；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 方法

采用10%水合氯醛，按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將麻醉好的大鼠捆于鼠板上，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（小動(dòng)物心電圖機(jī)），記錄術(shù)前大鼠心電圖情況。予以阿托品0.05 mL腹腔注射，大鼠頸部及左前胸部消毒備皮后，于胸骨上窩前正中線處切開(kāi)0.5~1 cm的縱形切口，依次鈍性分離氣管周邊組織，采用60 mL注射器針頭連接呼吸機(jī)軟管，于第2、3環(huán)狀軟骨間進(jìn)行插管，角度要小，以防穿破下層氣管，進(jìn)針約5 mm左右即可，呼吸機(jī)設(shè)置為容量控制模式，潮氣量為1.25 mL，呼吸頻率為75 次/min。輔助呼吸連接好后，用指尖觸心尖搏動(dòng)最強(qiáng)區(qū)，一般位于第4-5肋間，手術(shù)區(qū)碘伏消毒后于胸骨左緣旁開(kāi)約1 cm作一縱形切口，切口上下端不超過(guò)胸骨上下端，長(zhǎng)度約2 cm，而后鈍性分離胸部肌肉，分別用4-0縫合線將分離出來(lái)的肌肉穿線（折雙折）拉開(kāi)并固定于鼠板上以暴露肋骨，于第4-5肋間鈍性分離肋間肌，并在第4、5肋骨各掛1根4-0縫合線，拉開(kāi)2肋骨并將線固定于鼠板上，以充分暴露手術(shù)視野，撕開(kāi)胸膜，用小紗布沾生理鹽水后將肺壓向左側(cè)胸腔，以防結(jié)扎時(shí)損傷肺葉，撕開(kāi)心包膜，左手中指于大鼠右側(cè)胸腔稍用力往左推，右手持持針器于左心耳下緣2 mm入針，穿過(guò)左心耳與肺動(dòng)脈圓錐的交界，寬度約4 mm，深度約2 mm，以5-0帶線縫合針結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎后即刻記錄大鼠心電圖，心電圖標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高（≥0.1 mV）作為結(jié)扎成功的標(biāo)志（見(jiàn)圖1）。完成心電圖后，取出小紗布后立即關(guān)胸，完全閉合前，胸腔內(nèi)置入頭皮針的塑料吸管，連接20 mL注射器，完全閉合后，一邊抽吸一邊稍稍移動(dòng)胸腔內(nèi)的吸管，給胸腔造成負(fù)壓，待心率明顯加快后才可取出。采用連續(xù)縫合法縫合肌肉，在最后打結(jié)之前，用注射器連接軟管再次抽空肌肉內(nèi)的氣體，直至肌肉緊貼肋骨為止，最后縫合皮膚，完成關(guān)胸，并觀察心電圖，待心電圖平穩(wěn)后拔出氣管插管并縫合皮膚。術(shù)后大鼠腹腔內(nèi)注入8萬(wàn)U青霉素，連續(xù)3 d，預(yù)防感染，并取右側(cè)臥位置于單籠喂養(yǎng)，上方置以臺(tái)燈保溫。

1.3 心肌梗死模型的鑒定

1.3.1 心電圖檢查[4]冠脈結(jié)扎后即刻記錄大鼠心電圖，心電圖標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)ST段抬高（≥0.1 mV）作為結(jié)扎成功的標(biāo)志。

1.3.2 TTC染色 術(shù)后7 d處死大鼠，取出心臟，做TTC染色進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)納入SD大鼠85只，采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法制作大鼠心肌梗死模型，術(shù)前因麻藥原因死亡1只，術(shù)中因結(jié)扎過(guò)深致大出血死亡1只，術(shù)后因胸腔關(guān)閉不全死亡2只、呼吸道分泌物窒息死亡1只，成功完成心肌梗死造模80只，冠脈結(jié)扎后即刻行心電圖檢查，可見(jiàn)心率較快，約300次/min，ST段上移（見(jiàn)圖1），提示心肌梗死模型成立。心肌梗死模型制作的成功率為94.12%。術(shù)后7 d取材，肉眼觀察大鼠心臟缺血區(qū)的室壁變薄局部凹陷，顏色較周圍的心肌淺，心室壁?。ㄒ?jiàn)圖2）。大鼠心肌TTC有明顯改變，缺血區(qū)著色變淺（見(jiàn)圖3）。

圖1 大鼠冠脈結(jié)扎前后心電圖

圖2 心肌梗死大鼠冠脈結(jié)扎后心臟直觀圖

圖3 心肌梗死大鼠心臟TTC染色直觀圖

3 討論

冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法是心肌梗死造模的常用方法，為目前認(rèn)為最貼近心肌梗死生理狀態(tài)的方法，但因其操作繁瑣，制造模型用時(shí)較長(zhǎng)，其死亡率較高[6]，成功率僅為20%，增加了實(shí)驗(yàn)的難度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)改進(jìn)以下兩個(gè)關(guān)鍵步驟，提高造模成功率。

3.1 簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短操作時(shí)間

3.1.1 氣管插管 本實(shí)驗(yàn)采用60 mL注射器針頭連接呼吸機(jī)軟管后快速進(jìn)行氣管插管，一方面能減少因剪開(kāi)氣管所致分泌物增多而增加其窒息可能，另一方面快速一針插管可節(jié)省其操作時(shí)間。

3.1.2 開(kāi)胸及關(guān)胸 本實(shí)驗(yàn)開(kāi)胸時(shí)以縫合線替代牽開(kāi)器，一方面能擴(kuò)展手術(shù)視野，利于手術(shù)結(jié)扎操作，另一方面能避免牽開(kāi)器對(duì)肺的損傷，同時(shí)，牽拉的縫合線在關(guān)胸時(shí)可即刻使用，無(wú)需另外穿針引線，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

3.2 造模成功相關(guān)因素的探討

3.2.1 開(kāi)胸時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，開(kāi)胸時(shí)間長(zhǎng)短與造模后動(dòng)物存活率呈負(fù)相關(guān)，開(kāi)胸時(shí)間越短，動(dòng)物存活率越高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，減少實(shí)驗(yàn)用時(shí)，提高大鼠存活率。

3.2.2 胸腔負(fù)壓 胸腔負(fù)壓的形成是保證關(guān)胸后大鼠能否恢復(fù)自主呼吸非常關(guān)鍵的一步，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如若抽氣未完全，則大鼠關(guān)胸撤離呼吸機(jī)后，立刻死亡。本實(shí)驗(yàn)在縫合第4、5肋骨時(shí)，置入一輸液軟管，連接注射器，最后關(guān)閉胸腔時(shí)，必需要回抽胸腔氣體，造成胸腔負(fù)壓。此外，為了進(jìn)一步確保胸腔處于負(fù)壓狀態(tài)，連續(xù)縫合肌肉后，最后結(jié)扎前，置入一軟管，抽吸空氣至肌肉完全貼合肋骨。

3.2.3 呼吸的恢復(fù) 大鼠術(shù)后呼吸恢復(fù)與否直接影響造模成功率。手術(shù)期間因使用麻醉藥及氣管插管刺激可致氣管分泌物較多，易造成動(dòng)物窒息死亡。本實(shí)驗(yàn)使用注射器針頭進(jìn)行穿刺可以減少因剪開(kāi)氣管或反復(fù)軟管插管而對(duì)氣管造成的刺激，從而能有效減少氣管內(nèi)分泌液。術(shù)前予以阿托品腹腔注射，可有效減少因麻醉藥而致的腺體分泌過(guò)多，此外，胸腔負(fù)壓的恢復(fù)，利于術(shù)后動(dòng)物自主呼吸的恢復(fù)。

實(shí)驗(yàn)操作重在細(xì)節(jié)的把握，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制作心肌梗死模型是經(jīng)典造模方法，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)化相關(guān)步驟，注重實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，密切關(guān)注模型大鼠的呼吸、心率的恢復(fù)，從而提高模型動(dòng)物存活率。使冠脈結(jié)扎的方法更簡(jiǎn)單易行，為心肌梗死的基礎(chǔ)研究提供了另一種簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)方法。

[1]武陽(yáng)豐，周北凡，李 瑩，等.缺血性心血管病:一個(gè)反映血脂異常潛在危險(xiǎn)的新指標(biāo)[J].中華心血管病雜志，2004，32(2):173-176.

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（本文編輯 楊 瑛）

Discussion on the Simple Method for Myocardial Infarction Model Rats by Coronary Artery Ligation

ZHOU Min1,ZHANG Wei2*,LI Chengwen1,CHEN Cheng2,LI Li2,PAN Jiang2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China)

ObjectiveTo discuss the simple establishment method for cardiac ischemic model rats.MethodsThe rats were anesthetized,followed by tracheal intubation with artificial ventilation. Then the myocardial infarction models were produced by ligating the left coronary artery.The rats were killed at 7 days after operation.The heart was taken out to observe the shape,measure the range ofmyocardialinfarction by TTC staining.Results85 rats were builtformyocardial infarction models,and 80 survived.80 rats with myocardial infarction were confirmed by operative observation,electrocardiogram and TTC.ConclusionThis method for cardiac ischemic models is simple and with high survival rate,it also can reduce the death rate after the operation.Thatprovided an additional simple method for models.

myocardial ischemia;rat models;electrocardiogram;coronary artery ligation

R543.3，Q95-33

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2014.12.001.001.03

2014－08－23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273861）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11JJ5078）；湖南省科技廳科技計(jì)劃課題（2012FJ4361）。

周 敏，女，在讀碩士研究生，主要從事針灸治療機(jī)制的研究。

*章 薇，女，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:507395550@qq.com。