翟 帥，陳佩林

心臟是機(jī)體最重要的器官，也是胚胎期最早發(fā)育的器官。心臟肥厚性增長是對不同形式的損傷或應(yīng)激如高血壓、瓣膜疾病、心肌梗死等病理性和懷孕、機(jī)體自然生長、規(guī)律的身體活動、長期運動訓(xùn)練等生理性血液動力學(xué)超負(fù)荷的應(yīng)答［7，20］。病理性肥大往往伴隨著胎兒基因上調(diào)，心肌纖維化、心功能紊亂等有害事件，生理性肥大則以整個心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化為主要特征［26］。運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的心肌肥大是對長期血液動力超負(fù)荷應(yīng)答的重要生理代償，這種表型與肌小節(jié)的增加和心肌細(xì)胞的增長相關(guān)［19］。盡管心肌對運動訓(xùn)練的肥大應(yīng)答增加了心輸出量，并最終表現(xiàn)為運動能力和成績的提高，但運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的長期肥大仍然是心衰和突然死亡的重要危險因素。目前，已經(jīng)在識別參與運動心肌肥大的基因和信號通路方面取得了重要進(jìn)展，但運動心臟重塑的復(fù)雜性提示，可能有其他調(diào)節(jié)機(jī)制參與運動心臟的重塑。

miRNAs是一類長度約為18～25nt的非編碼RNA分子，它參與多種生物進(jìn)程，如細(xì)胞增殖和凋亡和應(yīng)激應(yīng)答等［8］。眾多的研究表明，miRNAs參與調(diào)節(jié)復(fù)雜的病理性心肌肥大過程［11，17，22］，如 miRNA－1［5］、miRNA－22［21］和miRNA－133［5］等在病理性心臟中顯著變化，并有研究探討了 miRNAs參與調(diào)控病理性心肌肥大的可能機(jī)制［12，27］。miRNAs與運動的關(guān)系正成為當(dāng)前運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點［1，4，13，24］。令人興奮的是 ，新近的研究發(fā)現(xiàn) ，miRNAs也參與調(diào)節(jié)運動心臟重塑。國內(nèi)外的研究表明，運動誘導(dǎo)的左心室肥大動物模型左心室中的miRNA－1、miRNA－133表達(dá)水平顯著下降 ，miRNA－208 表達(dá)水平顯著升高［1，4，13］。賈明學(xué)等認(rèn)為，運動心臟順應(yīng)性的提高可能與miRNA－30c的表達(dá)上升有關(guān)［1］。Fernandes等的研究發(fā)現(xiàn)，不同模式的游泳訓(xùn)練誘導(dǎo)的LVH（left ventricular hypertrophy，LVH，左心室肥大）大鼠模型的左心室中的 miRNA－27a、miRNA－27b均顯著上調(diào)，miRNA－143顯著下調(diào)［13］。Ma等發(fā)現(xiàn)，miRNA－124在游泳運動訓(xùn)練誘導(dǎo)的LVH大鼠模型中顯著下調(diào)，而 miRNA－21、miRNA－144和 miRNA－145顯著上調(diào)，他們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的miRNAs可能分別通過靶向其下游靶基因 PIK3α（miRNA－21）、PTEN（miRNA－21和 miRNA－144）和 TSC2（miRNA－145）激活PI3K／AKT／mTOR信號通路介導(dǎo)運動心臟重塑［18］。上述結(jié)果提示了miRNAs作為運動心臟重塑生物學(xué)標(biāo)志物的潛在價值，但仍需更多有關(guān)miRNAs功能的研究以進(jìn)一步明確這些miRNAs在運動誘導(dǎo)的心臟重塑中的作用。

目前，雖然大多數(shù)研究結(jié)果支持病理性心肌肥大和運動性心肌肥大并非殊途同歸，但運動性心肌肥大存在的嚴(yán)重不良預(yù)后，以及病理性心肌肥厚大和運動性心肌肥大中某些miRNAs的表達(dá)譜存在驚人的相似，這是否從表觀遺傳學(xué)機(jī)制上暗示兩者似乎存在某種關(guān)聯(lián)？在病理性心肌中異常表達(dá)的miRNAs是否也參與運動心臟重塑？最近，Ge［15］等發(fā)現(xiàn)，miRNA－350在腹主動脈窄縮術(shù)誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠左心室的表達(dá)顯著增高，但目前尚無這一在病理性心肌肥大中顯著差異表達(dá)的miRNA與運動誘導(dǎo)的心肌肥大關(guān)系的研究報道。因此，本研究考察長期遞增負(fù)荷的跑臺運動誘導(dǎo)的小鼠運動性心肌肥大模型左心室miRNA－350及其靶基因表達(dá)的變化，探討運動心臟重塑的可能機(jī)制，也期望能夠為病理性心臟疾病的運動干預(yù)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用96只8周齡雄性C57BL／6小鼠（由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供），平均體重為18.06±0.51g。小鼠購回后分籠常規(guī)飼養(yǎng)，每籠3只，自由飲食、飲水，自然光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，即普通對照組（control group，C組，n＝48只）和遞增負(fù)荷運動組（incremental load training group，ILT組，n＝48只）。C組和ILT組又隨機(jī)分為6個亞組，每組8只，分別在運動訓(xùn)練實施后的0d（適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后的第4d）、3d、7d、15d、29d和57d處死。

1.2 運動方案

動物購回飼養(yǎng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對ILT組小鼠進(jìn)行連續(xù)5d的適應(yīng)性遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練后再進(jìn)行正式訓(xùn)練（圖1）。為了避免急性運動的影響，適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后，ILT組小鼠在適應(yīng)性后休息3d，再進(jìn)行正式訓(xùn)練。LT組適應(yīng)性訓(xùn)練和正式訓(xùn)練方案參考了國外Gauthier［14］等和國內(nèi)學(xué)者［2－3］的相關(guān)研究，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良。ILT組的適應(yīng)性訓(xùn)練方案為：第1d起始強度為15m／min，持續(xù)12min。以后每天強度增加3m／min的同時將持續(xù)時間增加12min，即第2d以先以15m／min的強度訓(xùn)練12min，再以18m／min的強度再訓(xùn)練12min，以此類推，直至第5天的運動強度為27m／min，持續(xù)60min。ILT組的正式訓(xùn)練方案同于適應(yīng)性訓(xùn)練的第5d，不同的是，每1周的訓(xùn)練周期中安排兩次休息，即先安排連續(xù)3d的訓(xùn)練，然后休息1d；經(jīng)過1d休息調(diào)整后再訓(xùn)練2d，然后再休息1d，如此循環(huán)往復(fù)。ILT組進(jìn)入正式訓(xùn)練周期后，每周訓(xùn)練5 d，每次持續(xù)60min，維持64d（圖1）。訓(xùn)練過程中不用其他物理手段刺激（聲、光、電等）。在此過程中C組小鼠在跑臺上進(jìn)行相同時間的自由活動。

1.3 小鼠心臟超聲心動圖檢測

剩余小鼠在正式訓(xùn)練的第50d（最后一次取材前1周，C組n＝18，ILT組n＝18），左胸備皮后，腹腔注射氯胺酮麻醉后行超聲心動圖檢測（測試儀器為動物超聲心動圖檢測儀，VISUALSONICS，加拿大）。測試指標(biāo)為左心室收縮期心室后壁厚度（PWTS）和左心室舒張期后壁厚度（PWTD），左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），左心室舒張期隔膜厚度（IVSTD），左心室收縮期隔膜厚度（IVSTS）和射血分?jǐn)?shù)（EF）。

圖1 本研究ILT組小鼠適應(yīng)性訓(xùn)練和正式訓(xùn)練方案示意圖Figure 1. Adaptive Training and Formal Training Program of ILT Group Mice

1.4 實驗取材

實驗小鼠按照研究設(shè)計在訓(xùn)練結(jié)束后的次日，摘眼球取血后頸椎脫臼處死。其中，血液儲存于EDTA采血管，靜置30min后3 000rpm離心15min，取得血漿后－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。打開小鼠腹腔，獲取小鼠心臟后放入預(yù)冷的生理鹽水中，濾紙吸干后稱量濕重，小心剪下左心室壁稱重，隨后用鋁箔紙包好后投入液氮，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 總RNA提取

剪取左心室一小塊心肌組織稱重，按照每100mg心肌加入Trizol 1ml（Invitrogen）提取心肌總RNA，判斷RNA的濃度，并對RNA進(jìn)行質(zhì)檢。將部分總RNA通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO，F(xiàn)SK100）合成cDNA，－20℃冰箱備測JNK mRNA表達(dá)。

1.6 miRNA 反轉(zhuǎn)錄和 qRT－PCR 檢測 miRNA－350 表達(dá)水平

1.6.1 miRNA反轉(zhuǎn)錄

取適量總RNA進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。選用RIBBIO特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成 miRNA－350－莖環(huán)引物cDNA。20μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括1μg純化的總RNA，50nM莖環(huán)RT引物1μl（RIBBIO，廣州銳博），0.25mM dNTP 0.5μl（Promega），5U／μl M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl（Promega）和 0.25 U／μl RNase抑制酶0.2μl（Promega）。反應(yīng)條件為：16℃30min，42℃30min，85℃10min。

1.6.2 qRT－PCR檢測 miRNA－350表達(dá)水平

選用特異性的Bulge－LoopTM 正、反向引物對miRNA－350進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括22.5μl SYBR Green Mix（內(nèi)含Taq酶、dNTP Mix、PCR Buffer、SYBR GreenⅠ等），2μl RT 產(chǎn)物，Bulge－LoopTM miRNA 正向和反向引物（RIBBIO，廣州銳博）各5μl，DEPC水補足至50μl。miRNA－350的成熟序列為：3’UUCACAAAGCCCAUACACUUUC，其正、反向引物由銳博設(shè)計和合成。95℃20s預(yù)變性后，95℃變性10s，60℃退火20s，70℃延伸，共40個循環(huán)，內(nèi)參為U6，引物序列由銳博設(shè)計和合成，測試系統(tǒng)為Roter－Gene 6000檢測系統(tǒng)（Corbett）。

1.7 qRT－PCR檢測JNK mRNA表達(dá)水平

PCR反應(yīng)體積為10μl，包括10×緩沖液1μl，10mM的dNTP Mix 0.5μl，10mM 正反向引物各0.25μl，cDNA模板2.5μl，Taq DNA多聚酶0.2μl，SYBR green I 0.4μl。MAPK14的正向引物為5’CCGAACAAAGGGAGAACCG3’，反向引物為 5’TGGACTGCATACTGAGGCG 3’；JNK上游引物5’AAGACAGGGGAGCAGACG3’，反向引物5’GGTGGCAAGAAGGTGGAG3’。用 GAPDH 作為內(nèi)參，其正向引物序列為5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’，反向引物序列為5’GAAAGATGGTGATGGGATTTC 3’。反應(yīng)條件94℃下預(yù)變性120s，94℃10s，60℃15s，72℃30 s，反應(yīng)進(jìn)行40個循環(huán)。在Mx3000P多通道實時定量PCR 儀 （Stratagene，La Jolla，CA，USA）上進(jìn)行 Real－time PCR實驗。

1.8 Western blot檢測JNK蛋白的表達(dá)水平

取50mg心肌組織，剪碎后加入蛋白裂解液（碧云天，貨號：P0013）勻漿，4℃下14 000rpm離心30min，取上清，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。以濃度為10%的SDS－PAGE進(jìn)行電泳分離目的蛋白，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉，加入JNK（Santa cruz，sc－571）一抗孵育，4℃過夜，二抗孵育1h，經(jīng)顯色后曝光。蛋白表達(dá)水平用NIH圖像分析軟件（Bethesda，Maryland，USA）進(jìn)行分析，以 GAPDH 為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間采用 One－way ANVOA進(jìn)行比較，以P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物體重、心臟質(zhì)量等一般形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化

為評價長期遞增負(fù)荷的跑臺運動對小鼠一般身體形態(tài)指標(biāo)的影響，本研究檢測了對照組和運動組小鼠的體重、心臟質(zhì)量和左心室重等一般形態(tài)學(xué)指標(biāo)（圖2－A），并計算了心系數(shù)、心室體重比等衍生指標(biāo)（圖2－B）。結(jié)果表明，與對照組相比，ILT組小鼠體重略低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義；ITL組小鼠心臟質(zhì)量和左心室質(zhì)量顯著高于對照組（P＜0.01）；如圖2－B所示，ITL組小鼠心系數(shù)和左心室體重比均顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖2 本研究小鼠一般形態(tài)學(xué)指標(biāo)的比較柱狀圖Figure 2. Comparison of General Morphological Indexes in Each Group

2.2 實驗動物超聲心動圖檢測結(jié)果

在正式訓(xùn)練的第7周末，用動物超聲心動圖檢測了各組小鼠PWTS、PWTD、LVEDD、IVSTD和IVSTS等指標(biāo)的變化。如圖3所示，與對照組相比，ILT組小鼠PWTS、PWTD、LVEDD、IVSTD和IVSTS等指標(biāo)顯著高于C組（P＜0.01），ILT組小鼠EF的數(shù)值雖高于C組，但不具有顯著性差異。結(jié)果提示，運動組小鼠對遞增負(fù)荷運動產(chǎn)生了應(yīng)答，表現(xiàn)為左心室肥大。

圖3 本研究小鼠超聲心動圖結(jié)果的比較柱狀圖Figure 3. Comparison of the Results of Ultrasonic Cardiogram

2.3 運動心臟重塑不同時相miRNA－350和JNK mRNA表達(dá)的變化

本研究用實時定量PCR比較了遞增負(fù)荷跑臺運動誘導(dǎo)的運動性心肌肥大過程中不同時相對照組和運動組心肌組織中miRNA－350的表達(dá)水平。為了考察適應(yīng)性訓(xùn)練和急性運動對miRNA－350表達(dá)水平的影響，本研究檢測了適應(yīng)性訓(xùn)練后3d（0d）、正式訓(xùn)練后3d、7d、15d、29d和57d時等節(jié)點時miRNA－350表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ILT組小鼠的左心室中miRNA－350的表達(dá)水平在3d、7d、15 d時均顯著高于對照組（圖4－A），第29d和57d時的miRNA－350的表達(dá)水平無顯著性差異。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，在0d（適應(yīng)性訓(xùn)練后的第4d）和實施遞增負(fù)荷運動的第3d、7d，C組與ILT組小鼠左心室JNK mRNA的表達(dá)水平均無顯著性差異，JNK mRNA的表達(dá)水平在15d、29 d和57d時均顯著高于C組（圖4－B）。

2.4 運動心臟重塑過程中JNK mRNA蛋白表達(dá)的變化

本研究用 Western Blotting檢測了miRNA－350靶基因JNK蛋白的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明，0d（適應(yīng)性訓(xùn)練后的第4d）時，C組和ILT組小鼠左心室JNK蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異（圖5），遞增負(fù)荷運動3d和7d時ILT組小鼠左心室JNK蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，并呈現(xiàn)明顯的下降趨勢；15d時ILT組小鼠左心室JNK蛋白表達(dá)水平與對照組無顯著性差異，但顯著高于7d時的水平，在29d和57d時ILT組小鼠左心室JNK蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。

圖4 本研究qRT－PCR檢測miRNA－350和JNK mRNA的表達(dá)柱狀圖Figure 4. qRT－PCR to Determine the Expressions of miRNA－350and JNK mRNA

圖5 本研究JNK蛋白的表達(dá)水平的動態(tài)變化圖Figure 5. Dynamic Alternations of the Expressions of miRNA－350and JNK mRNA

3 討論與分析

3.1 遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練對心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響

目前，國內(nèi)外研究一般都用心系數(shù)（心系數(shù)是指心臟質(zhì)量／體重的比值）、左心室質(zhì)量與心臟質(zhì)量的比值等指標(biāo)作為判斷病理性和生理性心肌肥大發(fā)生的慣用指標(biāo)。本研究表明，經(jīng)過56d的遞增負(fù)荷的跑臺運動，ILT組小鼠心臟的絕對質(zhì)量明顯高于C組，ILT組小鼠體重雖低于C組，但沒有顯著性差異。ILT組小鼠心系數(shù)大于C組，有顯著性差異。C組小鼠左心室濕重明顯低于ILT組，左心室質(zhì)量與心臟質(zhì)量的比值也顯著低于ILT組，這與國內(nèi)外的研究報道相一致。此外，本研究還通過超聲心動圖技術(shù)檢測了遞增負(fù)荷的跑臺訓(xùn)練對小鼠PWTS、PWTD、LVEDD、IVSTD、IVSTD和EF等結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，ILT組小鼠等上述反應(yīng)心臟結(jié)構(gòu)和功能的指標(biāo)均顯著優(yōu)于C組。因此，8周遞增負(fù)荷的跑臺訓(xùn)練成功的復(fù)制了小鼠運動性心肌肥大模型。

3.2 miRNA－350與運動心臟重塑

miRNAs是一類大小約為22nt的非編碼RNA，它們通過與靶基因3′端UTR堿基完全或不完全互補的方式在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面發(fā)揮重要作用［6］。近年來的研究，在miRNAs表達(dá)模式與心血管疾病的關(guān)系方面取得了重要進(jìn)展［23，25］。最近，國內(nèi)外一些研究也證實，在運動性肥大心臟中存在一些 miRNAs的差異表達(dá)［1，4，7，13，24］。 然而 ，目前很少有研究探討在病理性心肌肥大中顯著差異表達(dá)的miRNAs在運動性心肌肥大中的表達(dá)情況及其運動性心肌肥大的關(guān)系。新近的一項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－350在動脈窄縮術(shù)小鼠的左心室中上調(diào)了約8倍，提示其參與了病理性肥大心臟的重塑調(diào)節(jié)，并且進(jìn)一步的功能研究發(fā)現(xiàn)，miRNA－350是心肌肥大的誘發(fā)因素而不是結(jié)果［15］。并且目前尚未有研究探討miRNA－350這一在病理性心肌肥大中顯著高表達(dá)的miRNA與運動誘導(dǎo)的心肌肥大的之間關(guān)聯(lián)。因此，本研究擬觀察miRNA－350在運動誘導(dǎo)的心肌肥大中的動態(tài)變化情況。本研究發(fā)現(xiàn)，在適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束時，C組和ILT組小鼠左心室miRNA－350的表達(dá)水平相當(dāng)。在正式訓(xùn)練后的第3d和7d時，ILT組小鼠心臟中miRNA－350的表達(dá)水平顯著高于C組；在遞增負(fù)荷運動訓(xùn)練的第15d時ILT組的miRNA－350表達(dá)水平雖有所下降，但仍然高于對照組。但在小鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷運動的第29d和第57d時，C組和ILT組小鼠心臟中miRNA－350表達(dá)水平相當(dāng)。因此，在運動心臟重塑過程中miRNA－350的表達(dá)水平呈現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢。從而推測miRNA－350可能參與啟動運動心臟重塑，但與病理性心肌肥大不同的是，miRNA－350參與調(diào)節(jié)運動心臟重塑從時程上來講是短暫的，其顯著的高表達(dá)只是出現(xiàn)在心肌對運動應(yīng)答的初期，這也可能是其他有關(guān)運動性心肌肥大的研究在模型建立成功時沒有檢測到miRNA－350差異表達(dá)的原因。GE等［15］的體內(nèi)外實驗研究證實，miRNA－350在病理性心肌肥大中高表達(dá)且能夠誘導(dǎo)或啟動心肌細(xì)胞肥大。本研究發(fā)現(xiàn)，在運動誘導(dǎo)心肌肥大的早期，miRNA－350表達(dá)水平升高，然而，心肌在一段時間的運動適應(yīng)后，miRNA－350表達(dá)水平顯著下降，這提示miRNA－350可能僅在運動心臟重塑的早期發(fā)揮作用，但miRNA－350在病理性心肌肥厚模型動物心臟中持續(xù)高表達(dá)，這可能是運動性心肌肥大和病理心肌肥大在分子調(diào)控機(jī)制上本質(zhì)區(qū)別之一。目前尚不能肯定的是，是否就是因為這種短暫的高表達(dá)就對運動心肌肥大的形成或不良預(yù)后產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響？因此，未來還應(yīng)通過miRNA－350antagomir或 miRNA－350基因敲除的嚙齒動物模型來明確miRNA－350在運動心臟重塑中的作用及其與運動性心肌肥大不良預(yù)后間的關(guān)系。

3.3 運動心臟重塑過程中 miRNA－350靶基因表達(dá)的變化

GE等［15］用生物信息學(xué)網(wǎng)站和miRNAs靶基因預(yù)測軟件預(yù)測出miRNA－350的靶基因為p38和JNK，并通過一系列的實驗證實，p38和JNK為miRNA－350的靶基因。JNKs（c－Jun N－terminal kinases，JNKs，c－Jun氨基末端激酶）和p38是MAPK信號級聯(lián)的兩個重要分支，它們是應(yīng)激或損傷應(yīng)答的特異的傳感器，因此，它們也被稱為SAPKs（stress－activated protein kinases ，SAPKs，應(yīng)激活化蛋白激酶）［28］。有研究表明，JNK可能是病理性心肌肥大必要的調(diào)節(jié)者［25］。目前的研究主要觀察了急性運動對心肌JNK信號的影響［9－10，16］，鮮有研究考察長期運動鍛煉對心肌JNK信號的影響，尤其缺乏對JNK信號在運動心臟重塑過程中動態(tài)變化的探討。以往的研究認(rèn)為，JNK信號通路參與調(diào)節(jié)病理性心肌肥大與miRNA－350相關(guān)，其機(jī)制為顯著增高的miRNA－350抑制了JNK信號的活性，使其下游的轉(zhuǎn)錄因子 NFAT（nuclear factor of activated T cells，NFAT，活化T細(xì)胞核因子）脫磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活了其下游與心肌肥厚相關(guān)基因的表達(dá)［15］。

本研究利用遞增負(fù)荷的跑臺運動構(gòu)建運動心肌肥大模型，并分別用qRT－PCR和Western Blot檢測了運動心臟重塑過程中miRNA－350的靶基因JNK的動態(tài)變化。結(jié)果表明，與對照組相比，在適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束時對照組和訓(xùn)練組小鼠左心室JNK mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異，提示適應(yīng)性訓(xùn)練沒有對JNK mRNA表達(dá)水平產(chǎn)生影響，或經(jīng)過3d的休息，適應(yīng)性訓(xùn)練產(chǎn)生的應(yīng)答已經(jīng)消退。正式訓(xùn)練的第3d和7d，JNK mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，但左心室JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低，且第7dJNK蛋白表達(dá)水平顯著低于第3d，結(jié)合這一階段miRNA－350的表達(dá)水平，本研究認(rèn)為，遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練初期心肌中的miRNA－350對運動產(chǎn)生了應(yīng)答，表現(xiàn)為 miRNA－350水平增高，增高的miRNA－350與JNK mRNA以不完全互補的形式結(jié)合，抑制了JNK mRNA的翻譯，進(jìn)而降低了JNK蛋白的表達(dá)。隨著運動訓(xùn)練的持續(xù)，運動心臟產(chǎn)生了良好適應(yīng)。一方面，表現(xiàn)為可作為病理心臟生物學(xué)標(biāo)志物的miRNA－350表達(dá)水平在第15d時顯著下降，在第29d和57d時ILT組左心室miRNA－350的表達(dá)水平已與對照組相當(dāng)；另一方面，miRNA－350的靶基因JNK的mRNA和蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，在遞增負(fù)荷運動訓(xùn)練結(jié)束時，JNK mRNA和JNK蛋白表達(dá)水平高于對照組。綜上所述，在運動訓(xùn)練初期miRNA－350表達(dá)水平顯著增高，且JNK蛋白表達(dá)水平顯著下降，說明miRNA－350可能參與運動心臟重塑早期JNK信號通路的調(diào)節(jié)，并暗示處于運動心臟重塑早期的心臟可能有病理性心肌肥大的表征；但隨著運動訓(xùn)練的持續(xù)，這些不良的表征出現(xiàn)了消退，表現(xiàn)為心肌miRNA－350表達(dá)水平降低，JNK mRNA和JNK蛋白表達(dá)水平升高。因此，本研究初步證實，8周遞增負(fù)荷的跑臺運動可能是經(jīng)由miRNA－350／JNK信號通路參與運動心臟重塑調(diào)節(jié)，其確切的機(jī)制還有待于通過miRNA－350轉(zhuǎn)基因動物模型或miRNA－350antagomir進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。同時，未來研究還應(yīng)當(dāng)使用高通量miRNA基因芯片等技術(shù)篩選和驗證出在運動心臟重塑不同階段顯著差異表達(dá)的miRNAs，并重點關(guān)注那些在病理性心肌肥大中顯著差異表達(dá)的miRNAs在運動心臟重塑中的變化，以進(jìn)一步明晰病理性心肌肥大與運動性心肌肥大的機(jī)制，厘清兩者的區(qū)別與關(guān)聯(lián)，為運動訓(xùn)練實踐和心臟疾病的防治服務(wù)。

4 結(jié)論

1.超聲心動圖檢測發(fā)現(xiàn)，8周遞增負(fù)荷跑臺運動后小鼠PWTS、PWTD、LVEDD、IVSTD和IVSTS等指標(biāo)顯著上升，提示持續(xù)8周的遞增負(fù)荷跑臺運動誘導(dǎo)了小鼠心肌肥大。

2.運動心臟重塑過程中 miRNA－350、JNKmRNA和JNK蛋白水平呈現(xiàn)動態(tài)變化，遞增負(fù)荷的跑臺運動可能通過調(diào)節(jié)miRNA－350／JNK信號通路參與運動心臟重塑。

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