周小龍，魏春陽(yáng)，黃 佳，史艷梅，王 皓，羅朝鵬，李 鋒，王 燃*，楊 軍，陳繼峰，林福呈

1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

2.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

3.中國(guó)煙葉公司，北京宣武區(qū)廣安門外大街9號(hào) 100055

植物在正常生長(zhǎng)條件下和逆境中均能產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），并產(chǎn)生一套復(fù)雜有效的系統(tǒng)來(lái)維持體內(nèi)活性氧的平衡［1-2］。在正常生長(zhǎng)條件下，植物細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧能及時(shí)被自身的抗氧化系統(tǒng)清除，而當(dāng)植物處于干旱、淹水、病害和紫外輻射等逆境中時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量活性氧的積累，若不及時(shí)清除會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重傷害。超氧自由基（O2-·）是活性氧中的一種，是葉綠體光合系統(tǒng)Ⅰ電子傳遞過(guò)程的產(chǎn)物，O2-·應(yīng)及時(shí)在其合成的部位被清除以免產(chǎn)生危害更大的羥基自由基，完成這一任務(wù)的是Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Zn-Superoxide Diamutase,Cu/Zn-SOD），該酶和O2-·產(chǎn)生的位置均位于細(xì)胞葉綠體的類囊體上。Bowler等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，氧化脅迫可以誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)來(lái)清除過(guò)多的O2-·。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是生物體有效清除活性氧的重要抗氧化酶類［4］。Cu/Zn-SOD與植物的抗旱、抗鹽堿、耐低溫高溫等多種抗逆性狀密切相關(guān)［5］。miRNA是一類內(nèi)源的、長(zhǎng)約20~24個(gè)堿基的RNA分子，通過(guò)mRNA降解和翻譯抑制等方式，特異地對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA調(diào)控Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平的研究源于模式植物擬南芥，有研究表明，Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)水平取決于miRNA398水平［6］。當(dāng)植物處于正常生長(zhǎng)情況下Cu/Zn-SOD基因進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄，但由于在miRNA398介導(dǎo)下的降解過(guò)程其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并不累積，植物受到逆境脅迫（干旱）時(shí)miRNA398的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致Cu/Zn-SOD基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，植物進(jìn)而表現(xiàn)出抗氧化能力。轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明，miRNA398在調(diào)控Cu/Zn-SOD基因表達(dá)和逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用［6］。煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其抗逆性尤其是抗旱能力受到普遍關(guān)注。煙草miRNA398是否具有調(diào)控其Cu/Zn-SOD基因表達(dá)的生物學(xué)功能，能否通過(guò)調(diào)控Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究和比較了兩個(gè)煙草品種在正常與逆境脅迫條件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量的變化，并分析了miRNA398結(jié)合Cu/Zn-SOD基因的靶位點(diǎn)，旨在揭示煙草miRNA398的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 煙苗培養(yǎng)

選用白肋煙B37和烤煙CB-1品種，采用l/3濃度的Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液水培，具體操作參照田陽(yáng)陽(yáng)等的方法［7］。對(duì)照組按正常條件管理，干旱處理采用含20%PEG6000（質(zhì)量體積比）的培養(yǎng)液水培處理2 d后取樣。取樣時(shí)煙株根系先用自來(lái)水沖洗，最后用去離子水沖洗干凈。吸水紙吸干表面水分后分開(kāi)根、莖和葉取樣。液氮速凍后超低溫冰箱中保存，用于RNA提取。

1.1.2 試劑和試劑盒

DNA聚合酶、DNA酶、PMD-19-sample-T載體、One Step PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒、小RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq II和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為日本Takara公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物

根據(jù)煙草（Nicotiana tabacum）Cu/Zn-SOD的CDS保守序列設(shè)計(jì)引物，用于克隆基因全長(zhǎng)編碼區(qū)引物：上游引物P1 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P2 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；用于mRNA熒光定量PCR擴(kuò)增引物：上游引物P3 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P4 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；miRNA 前體引物，上游引物P5為5’-TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG-3’，下游引物P6為小RNA提取試劑盒自帶的Uni-miR定量PCR引物；熒光定量PCR內(nèi)參基因Actin引物：上游引物5’-CTGGCATTGCAGATCGTATA-3’，下游引物5’-GCGCC ACCACCTTGA TCTT-3’。 除自帶引物外，其他引物由寶生物工程有限公司商業(yè)合成，純度為PAGE級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定

參照曾建敏等［8］的方法測(cè)定葉綠素含量，并采用SPSS分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 煙草小RNA和總RNA的提取

采用小RNA提取試劑盒提取煙草葉片小RNA，使用Trizol法提取總RNA。1.2.3 單鏈cDNA的合成

以所提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，以O(shè)ligo（dT）18為引物合成總RNA的cDNA第一鏈。

1.2.4 定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)

小RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，分別以miRNA398和Actin引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25μL：SYBR Green PCR Master Mix 12.5μL，miRNA398前體引物 P5（10μmol/L）和Uni-miR定量PCR引物（P6，10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，滅菌水 8.5μL。反應(yīng)程序：95 °C預(yù)變性3 min；95 °C變性15 s，58 °C退火20 s，72 °C延伸20 s，39個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸10 min。每個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)3次。內(nèi)參基因Actin的PCR采用同樣的程序。

總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，分別以Cu/Zn-SOD和Actin引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL：SYBRPremix Ex Taq II 10μL，引物 P3和P4（10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，滅菌水6μL。反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性3 min；95°C變性15 s，52°C退火20 s，72°C延伸20 s，39個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。內(nèi)參基因Actin的PCR采用同樣的程序。每個(gè)待測(cè)樣品cDNA設(shè)置3次重復(fù),對(duì)得到的 3 個(gè) Cp 值取平均值,用 2-ΔΔCp法計(jì)算［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)品種煙草葉片葉綠素的含量比較

經(jīng)測(cè)定，白肋煙B37的總?cè)~綠素含量比CB-1低（表1）。表1結(jié)果表明，CB-1干旱處理后葉綠素含量下降34%，而B(niǎo)37下降45%。同一品種干旱處理后的葉綠素含量比正常條件下降低，說(shuō)明干旱導(dǎo)致煙草植株質(zhì)體膜系統(tǒng)受損，引起葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷，葉綠素降解，從而表現(xiàn)為葉綠素含量減少。因此，色素含量分析表明B37比CB-1更容易受到干旱脅迫的損傷。

表1 不同處理煙草樣品中的葉綠素含量 （mg/g）

2.2 miRNA398的表達(dá)分析

對(duì)干旱和對(duì)照共4個(gè)樣品得到的小RNA進(jìn)行了miRNA398的表達(dá)量分析，熒光定量PCR的結(jié)果（圖1）表明，烤煙CB-1經(jīng)過(guò)干旱脅迫后，miRNA398的表達(dá)水平上調(diào)，而白肋煙B37經(jīng)過(guò)干旱脅迫后，miRNA398的表達(dá)水平下降；且干旱脅迫后CB-1體內(nèi)的miRNA398表達(dá)量顯著高于B37，說(shuō)明miRNA398參與了干旱脅迫的響應(yīng)，且兩個(gè)品種對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)出正應(yīng)答和負(fù)應(yīng)答兩種不同的響應(yīng)方式。擬南芥受干旱脅迫后，通過(guò)miRNA398調(diào)控靶基因Cu/Zn-SOD清除植物細(xì)胞中活性氧，從而提高植物對(duì)逆境反應(yīng)的耐受性［6］。因此，需要進(jìn)一步驗(yàn)證兩個(gè)品種煙草體內(nèi)Cu/Zn-SOD基因表達(dá)的變化。B37體內(nèi)miRNA398在干旱脅迫條件下表達(dá)量下降，可能會(huì)引起Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量的進(jìn)一步提高而應(yīng)對(duì)逆境脅迫。CB-1體內(nèi)miRNA398在干旱脅迫條件下表達(dá)量上升，因此Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量可能下降，推測(cè)CB-1體內(nèi)可能是其他的抗氧化機(jī)制在應(yīng)對(duì)干旱脅迫，說(shuō)明miRNA398在兩個(gè)品種體內(nèi)對(duì)相同脅迫產(chǎn)生了不同的響應(yīng)?？购的芰^弱的B37可能是通過(guò)低表達(dá)miRNA398而獲得Cu/Zn-SOD基因的高表達(dá)來(lái)彌補(bǔ)其抗逆能力的不足。

圖1 miRNA398在不同煙草品種中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 Cu/Zn-SOD基因在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)情況

對(duì)4種處理的樣品得到的總RNA進(jìn)行了Cu/Zn-SOD的表達(dá)量分析，熒光定量PCR的結(jié)果（圖2）表明，正常條件下B37體內(nèi)的Cu/Zn-SOD表達(dá)量顯著低于CB-1；在干旱脅迫條件下，B37體內(nèi)miRNA398表達(dá)水平下調(diào)，造成靶基因Cu/Zn-SOD的表達(dá)量顯著提高。Cu/Zn-SOD基因是脅迫信號(hào)的應(yīng)答因子，在正常條件下，Cu/Zn-SOD作為一種抗氧化酶可以將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，盡管過(guò)氧化氫仍是對(duì)機(jī)體有害的活性氧，但植株體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶可以將其完全分解為水，使植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡［4］。干旱條件下葉綠素合成受阻，自由基含量上升，Cu/Zn-SOD表達(dá)量上升消除了自由基對(duì)植物細(xì)胞帶來(lái)的損傷，葉綠素降解減緩，說(shuō)明B37可能通過(guò)低表達(dá)miRNA398來(lái)提高Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)量以彌補(bǔ)活性氧清除能力的不足；同時(shí)干旱脅迫條件下，miRNA398的表達(dá)量進(jìn)一步下降，引起Cu/Zn-SOD基因表達(dá)量的進(jìn)一步提高，從而增強(qiáng)了煙株的抗氧化能力來(lái)應(yīng)對(duì)逆境脅迫。正常情況下，雖然Cu/Zn-SOD基因被轉(zhuǎn)錄，但由于miRNA398所介導(dǎo)的特異降解，Cu/Zn-SOD的mRNA并不積累。在干旱脅迫條件下，miRNA398的表達(dá)量降低，解除了對(duì)Cu/Zn-SOD基因的抑制，即Cu/Zn-SOD基因的mRNA表達(dá)量升高。有研究［6］顯示，表達(dá)具有miR398抗性的Cu/Zn-SOD基因擬南芥突變體，Cu/Zn-SOD基因 mRNA表達(dá)量增高，其蛋白卻沒(méi)有增加，這表明miR398可能是通過(guò)抑制靶標(biāo)的翻譯進(jìn)而對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控。而CB-1在經(jīng)過(guò)干旱處理后，miRNA398的表達(dá)水平上調(diào)，Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)量降低，可能是其產(chǎn)生了更加復(fù)雜的抗氧化機(jī)制。

圖2 Cu/Zn-SOD基因在不同煙草樣品中的相對(duì)表達(dá)量

2.4 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的結(jié)合位點(diǎn)

在植物和動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，miRNA和靶mRNA結(jié)合的程度和部位不同，會(huì)造成不同的作用方式。動(dòng)物的miRNA多數(shù)與其靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)的識(shí)別位點(diǎn)以不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合，以阻礙翻譯機(jī)器對(duì)該mRNA的翻譯來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。絕大多數(shù)的植物miRNA與其靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)相似［10］。圖3顯示，煙草miR398與Cu/Zn-SOD基因的5′非翻譯區(qū)（5′UTR）有16個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)，說(shuō)明miR398與Cu/Zn-SOD基因的作用位點(diǎn)（結(jié)合互補(bǔ)區(qū)域）位于該基因的5′UTR。

圖3 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因結(jié)合位點(diǎn)分析

3 結(jié)論和討論

煙草miRNA398與Cu/Zn-SOD基因mRNA作用的位點(diǎn)在該基因的5′UTR區(qū)域，表明煙草miRNA398可能參與抑制Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)。兩個(gè)煙草品種miRNA398調(diào)控Cu/Zn-SOD基因表達(dá)對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)不同，干旱脅迫條件下CB-1的miRNA398表達(dá)水平上升，B37的miRNA398表達(dá)水平下降，而對(duì)應(yīng)CB-1的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平下降，B37的Cu/Zn-SOD基因表達(dá)水平上升。對(duì)于煙草不同品種相同基因出現(xiàn)不同的表達(dá)模式，已有研究發(fā)現(xiàn)［11］14個(gè)煙草品種中Cu/Zn-SOD基因?qū)τ诘蜏厝豕饷{迫的反應(yīng)不同，表明其生物學(xué)功能在不同品種中可能發(fā)生了變化。但miRNA398調(diào)控Cu/Zn-SOD基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)機(jī)制尚需要更多的證據(jù)。

miRNA398通過(guò)介導(dǎo)Cu/Zn-SOD基因mRNA的降解，在多個(gè)不同脅迫中可能充當(dāng)共同的應(yīng)答元件［12］，與植物響應(yīng)逆境脅迫密切相關(guān)；脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)多數(shù)受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，同時(shí)在染色質(zhì)水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平也受到精細(xì)的調(diào)控［13］。如miRNA398是植物在銅素缺乏條件下介導(dǎo)銅素蛋白穩(wěn)定的重要調(diào)控因子［14］。miRNA398家族包括miRNA398a，miRNA398b和miRNA398c，Yamasaki等［15］對(duì)擬南芥 miRNA398 進(jìn)行順式作用元件分析，在miRNA398b和miRNA398c的啟動(dòng)子區(qū)域分別發(fā)現(xiàn)了8個(gè)GTAC序列，而GTAC序列是生物體缺銅應(yīng)答的必需元件。miRNA398的表達(dá)主要依賴于轉(zhuǎn)錄因子SPL7直接結(jié)合到miRNA398啟動(dòng)子區(qū)的GTAC序列。本研究推測(cè)miRNA398在兩個(gè)煙草品種間存在不同的抗逆響應(yīng)機(jī)制，因此，miRNA398的遺傳學(xué)特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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