成 振 嚴(yán) 鵬 白麗娟 賈琳娜 郭大瑋

山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001

越來(lái)越多的研究資料表明，來(lái)自雙親的同源染色體或者等位基因有功能上的差異：有些只有父源的基因有轉(zhuǎn)錄活性，而母源的等位基因則一直處于沉默狀態(tài)，另一些基因的情況則相反。這是由于來(lái)源于某一親本的等位基因或其所在的染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾，導(dǎo)致不同親本來(lái)源的兩個(gè)等位基因在子代細(xì)胞中表達(dá)不同。這種親緣依賴(lài)的差異表達(dá)現(xiàn)象被稱(chēng)為基因組印記，受印記機(jī)制調(diào)控而差異表達(dá)的基因稱(chēng)之為印記基因[1]，許多與印記基因和印記控制中心鄰近的序列存在DNA甲基化修飾及差異甲基化序列[2]，目前對(duì)于甲基化的研究多采用甲基化敏感性酶限制性?xún)?nèi)切酶-PCR法[3]。它是利用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)甲基化區(qū)不切割而對(duì)未甲基化區(qū)切割的特性，將DNA消化為大小不同的片段后再進(jìn)行分析的一種研究甲基化的方法[4-5]。目前用甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶酶切的DNA大多是用有機(jī)溶劑法（酚/氯仿）提取或純化的DNA，而未見(jiàn)Chelex-100法提取DNA作為酶切底物應(yīng)用于差異甲基化基因座檢測(cè)的報(bào)道。本研究對(duì)Chelex-100法提取的DNA應(yīng)用于差異甲基化的檢測(cè)進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

100份無(wú)關(guān)人血由山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心提供；HhaⅠ購(gòu)自NEB公司；試驗(yàn)中引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易公司合成，OPC純度。Taq酶和Ex Taq Hot Start Version購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.2 基因組DNA的提取

Chelex-100法提取人血DNA：①向1.5 ml EP管中加入1 ml去離子水，取20μl的枸櫞酸鈉抗凝樣本至1.5 ml EP管中，充分振蕩混勻，室溫靜置20 min，以裂解紅細(xì)胞，13 000 r/min離心5 min，棄去液體；②加入1 ml滅菌去離子水，振蕩混勻按上述步驟反復(fù)用滅菌去離子水洗滌，直至上清液無(wú)色；③加入20 mg/ml蛋白酶 K 2 μl，56℃水浴 60~90 min，100℃沸水煮15 min，使蛋白充分變性，Chelex-100滅活；④13000r/min離心5 min，吸取上清液至另一EP管中備用。

酚/氯仿法提取人血DNA：①400μl抗凝血中加加入1 ml滅菌去離子水，振蕩混勻，13 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細(xì)胞沉淀中再用1 ml去離子水懸浮，混勻后離心，重復(fù)數(shù)次至上清液變?yōu)闊o(wú)色為止；②上述處理后的樣品加TKM2500μl，20 mg/ml PK 3μl混勻后于56℃水浴3～5 h，至液體完全透明；③一次等體積苯酚，一次苯酚/氯仿，一次氯仿抽提，每次抽提需要小心水相和油相充分混勻，13 000 r/min離心5 min，盡量將水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中；④向上清液中加2.5倍體積的冰無(wú)水乙醇，同時(shí)加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，混勻后在-20℃沉淀1 h，14 000 r/min離心20 min，棄去上清液，加入 3倍體積75%空氣干燥，采用適量的去離子水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 定量模板量

經(jīng)典酚/氯仿法提取DNA的定量：紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260并定量；Chelex-100法提取DNA的定量：qPCR絕對(duì)定量。

1.4 篩選雜合子

對(duì)Chelex-100法提取的基因組DNA以CD作為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，50 μl體系：10×PCR Buffer 5 μl，dNTP混合物4μl，10μmol/L引物1μl，Taq聚合酶1.25U，模板約40 ng，去離子水補(bǔ)至50μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)，純合子為一條帶，雜合子為兩條帶。

1.5 對(duì)雜合子樣本基因組DNA用甲基化敏感酶HhaⅠ消化

酶切體系20μl：雜合子樣本基因組DNA約20 ng，HhaⅠ 30 U，10×Buffer4 2 μl，BSA 0.2 μl，去離子水補(bǔ)齊至 20 μl，37℃ 15 h，65℃ 20 min 停止酶切離心后備用。

1.6 對(duì)甲基化敏感酶HhaⅠ處理過(guò)的雜合子基因組DNA用AB引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

50 μl體系：2GC×PCR Buffer 25 μl，dNTP 混合物4 μl，10 μmol/L AB 引物 1 μl，Ex Taq Hot Start Version 1.25 U，模板4μl，去離子水補(bǔ)至50μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.7 以AB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板用CD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

50μl體系：10×PCRBuffer 5 μl，dNTP 混合物 4 μl，10 μmol/L CD 引物 1 μl，Taq酶 1.25 U，模板 4 μl，去離子水補(bǔ)至50μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，20 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 3 min，將CD引物擴(kuò)增后產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分離，254 nm紫外燈下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

6泳道只擴(kuò)增出父源一方的等位基因，表明此位點(diǎn)確為差異甲基化位點(diǎn)。1、3泳道也只擴(kuò)增出父源一方等位基因，表明HhaⅠ在Chelex-100法提取的DNA中也能夠工作，Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物用于差異甲基化基因座的檢測(cè)（圖1）。

圖1 以AB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板用CD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果圖圖上方為陰極，下方為陽(yáng)極，1、3泳道為不同樣本Chelex-100法提取的DNA加酶實(shí)驗(yàn)組；2、4泳道為1、3泳道未加酶 （由等量去離子水代替）的陰性對(duì)照組；6泳道為酚/氯仿法提取DNA加酶陽(yáng)性對(duì)照組；7泳道為6泳道未加酶（由等量去離子水代替）的陰性對(duì)照組；泳道5為 Maker，大小 500 bp

3 討論

Chelex-100法提取的DNA能夠作為酶切底物應(yīng)用于差異甲基化基因座的檢測(cè)，筆者認(rèn)為有以下兩方面的原因：①法醫(yī)實(shí)際工作中用Chelex-100提取法提取的DNA一般用于進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系中DNA聚合酶一般除具有耐高溫的特性外，其他性質(zhì)與一般的生物酶相類(lèi)似。②影響限制性?xún)?nèi)切酶酶切反應(yīng)效率的因素包括DNA純度、反應(yīng)緩沖液、溫度、pH值等。其中提取的DNA中包含有蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、金屬離子等雜質(zhì)，會(huì)影響限制性?xún)?nèi)切酶的活性，從而影響酶切反應(yīng)的效率，而Chelex-100提取法提取的DNA中一般不會(huì)存在酚、氯仿、乙醇、SDS 等物質(zhì)，且 Chelex-100 會(huì)螯合 Al、Ca、Zn、Mg、Cu、Fe、Ag、Be等常見(jiàn)的影響酶活性的金屬離子，在56℃水浴過(guò)程中加入PK，能夠使蛋白充分消化，減少蛋白對(duì)酶切反應(yīng)的影響。100℃煮沸使蛋白變性，Chelex-100滅活，通過(guò)離心去除Chelex-100顆粒，使這些和Chelex-100結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離，以免影響下一步的酶切反應(yīng)。

隨著法醫(yī)實(shí)踐中應(yīng)用甲基化敏感性酶限制性?xún)?nèi)切酶-PCR法對(duì)差異甲基化聯(lián)合STR位點(diǎn)[6]，差異甲基化聯(lián)合SNP位點(diǎn)的研究越來(lái)越多[7]。酚/氯仿法提取的DNA雖然具有較高的純度，但是操作復(fù)雜、步驟繁多、耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，而且提取的DNA可能含有酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑，這些物質(zhì)都會(huì)對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶的活性具有一定的影響[8]。相比而言，Chelex-100提取法具有操作簡(jiǎn)單、檢材耗費(fèi)少、省時(shí)省力的特點(diǎn)[9]，并且該方法中用到的試劑基本無(wú)毒。在法醫(yī)工作實(shí)踐中酚/氯仿法提取的DNA檢材需求量大，而Chelex-100法用于微量檢材DNA的提取在實(shí)踐中已得到廣泛的應(yīng)用[10]，本研究也為差異甲基化能夠應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐提供了依據(jù)。

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