韋姍姍，陸雪萍，彭玲芳，屈會化，孫曄，王慶國#（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)“經(jīng)典方劑的應(yīng)用基礎(chǔ)研究”創(chuàng)新團隊，北京 100029；.云南省藥物研究所，昆明 650111）

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是重要的神經(jīng)信息傳遞物質(zhì)，廣泛存在于中樞神經(jīng)以及外周組織內(nèi)，主要包括去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、腎上腺素（Epinephrine，E）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）等，目前認為精神類疾病與其關(guān)系密切[1]。市場上現(xiàn)有的抗抑郁藥物主要是基于腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平過低的機制開發(fā)的[2]。因而準確測定腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量對于抗抑郁藥物的藥效與機制研究具有重要的意義。目前關(guān)于腦內(nèi)單胺遞質(zhì)的檢測方法很多，其中高效液相色譜-電化學(xué)（HPLC-ECD）法是報道最多、應(yīng)用最廣的方法。現(xiàn)有文獻中流動相主要采用等度洗脫，而NE極性較強，反相柱吸附能力較弱，因而出峰快；而5-HT極性較弱，出峰慢，若采用等度洗脫，存在NE峰分離度差或者5-HT出峰時間過長的問題。因此根據(jù)本實驗室的條件，筆者建立了一種實用、靈敏、簡便的HPLC-ECD梯度洗脫方法，能快速同時測定大鼠不同腦區(qū)內(nèi)NE和5-HT的含量，為進一步研究單胺類神經(jīng)遞質(zhì)奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀及2465電化學(xué)檢測器（美國Waters公司）；5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑:9.5 cm）；AG285電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

NE標準品（哥倫比亞Matrix Scientific公司，批號:037692，供含量測定用）；5-HT標準品（批號:91M5163V，供含量測定用）和內(nèi)標2，5-二羥基苯甲酸（DHBA，批號:MKBG3214V）均購自美國Sigma公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為高純水。

1.3 動物

SD大鼠15只，♀，SPF級，體質(zhì)量300～350 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號為:SCXK（粵）2008-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 蛋白沉淀液。取濃高氯酸溶液和乙二胺四乙酸（EDTA）適量，稀釋為含高氯酸0.1 mol/L和EDTA 0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。

2.1.2 標準品溶液。精密稱取NE、5-HT標準品適量，以蛋白沉淀液溶解，分別配制成質(zhì)量濃度為21 μg/ml和5 μg/ml的貯備液，臨用前用蛋白沉淀液稀釋成NE質(zhì)量濃度為0.084、0.252、0.42、0.84、2.1、4.2 μg/ml，5-HT質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.25 μg/ml的系列標準品溶液。

2.1.3 內(nèi)標工作液。精密稱取DHBA適量，用蛋白沉淀液溶解配制成質(zhì)量濃度為4 mg/L的溶液。

2.1.4 樣品溶液。大鼠脫頸椎處死，開顱迅速取出整個腦組織，分離各腦區(qū)，用適量0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水）沖洗，用吸水紙吸干，稱質(zhì)量，以一定比例加入蛋白沉淀液，冰浴下手動勻漿，取勻漿液14000 r/min低溫離心30 min，取上清液再14000 r/min低溫離心25 min，取一定量上清液按比例加入一定量的內(nèi)標工作液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱為DIKMA C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:緩沖鹽溶液[100 mmol/L醋酸鈉、3 mmol/L庚烷磺酸鈉、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、85 mmol/L檸檬酸]-甲醇，梯度洗脫，流速:1.0 ml/min；工作電壓:+0.7 V；柱溫:25℃；進樣量:20μl。流動相洗脫程序見表1。

2.3 系統(tǒng)適用性研究

取NE和5-HT混合標準品溶液+內(nèi)標、空白溶劑（蛋白沉淀液）進樣測定，記錄色譜；另取大鼠大腦皮層樣品、小腦樣品、海馬樣品、下丘腦樣品、嗅球樣品，按“2.1.4”項下方法制成溶液，進樣測定，記錄色譜。結(jié)果標準品和腦組織中的各峰形對稱，內(nèi)源性雜質(zhì)無干擾，NE、內(nèi)標、5-HT的保留時間分別約為5、8、18 min，NE、5-HT達到良好分離。色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution conditions

圖1 高效液相色譜圖A.標準品+內(nèi)標；B.空白溶劑；C.大腦皮層樣品；D.小腦樣品；E.海馬樣品；F.下丘腦樣品；G.嗅球樣品Fig 1 HPLC chromatogramsA.standard substance+internal standard；B.blank solvent；C.pallium sample；D.cerebellum sample；E.hippocampus samples；F.hypothalamus sample；G.apophysis mamitlaris sample

2.4 線性范圍考察

由于腦組織中原本就含有NE、5-HT，故不能直接用腦組織進行線性范圍考察。故用蛋白沉淀液將標準品溶液稀釋成含 NE 0.084、0.252、0.42、0.84、2.1、4.2 μg/ml，含 5-HT 0.005、0.01、0.02、0.1、0.2、0.25 μg/ml的系列混合標準品溶液，按比例加入內(nèi)標溶液，進樣測定。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標、標準物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值（y）為縱坐標進行回歸分析。得NE回歸方程為y＝5.292x－0.1474（r＝0.9999），檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.084～4.2 μg/ml；5-HT回歸方程為y＝59.057x－0.1303（r＝0.9991），檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.005～0.25 μg/ml。

2.5 提取回收率試驗

取一定量的NE標準品2份，其中1份加入全腦樣品溶液，處理后測得NE峰面積記為A1；1份加入蛋白沉淀液并稀釋至相同濃度，測得NE峰面積記為A3；另外測得全腦樣品溶液（未加標準品）的NE峰面積記為A2；計算NE提取回收率＝（A1－A2）/A3×100%。同法測得5-HT的提取回收率，結(jié)果見表2。

表2 提取回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of extraction recovery tests（n＝3）

2.6 加樣回收率試驗

因NE、5-HT為內(nèi)源性物質(zhì)，故用加入法測定回收率，即向已知濃度的全腦樣品溶液中加入一定量的NE、5-HT標準品溶液，處理后進樣測定，計算方法回收率＝（測得量－樣品含量）/加入量×100%，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of recovery tests of added index（n＝3）

2.7 精密度試驗

取同一份全腦樣品，加入NE、5-HT標準品溶液制備成高、中、低3種質(zhì)量濃度的樣品溶液，分別于同日內(nèi)0、2、4、6、8 h重復(fù)測定5次，考察精密度。結(jié)果NE的RSD＝2.76%（n＝5），5-HT的RSD＝3.00%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

將已知NE、5-HT質(zhì)量濃度的樣品溶液3份，分別置于常溫下存放，于處理后第1、2、3天測試其含量，考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果NE的RSD＝1.87%（n＝3），5-HT在第2天含量有大幅下降，表明腦組織中NE在常溫下至少能穩(wěn)定3 d，而5-HT僅能穩(wěn)定1 d。

2.9 樣品含量測定

根據(jù)“2.1.4”項下的制備方法，分別制備6只大鼠的大腦皮層樣品溶液、小腦樣品溶液、海馬樣品溶液、下丘腦樣品溶液、嗅球樣品溶液，測定其中NE、5-HT含量，結(jié)果見表4。

表4 NE、5-HT在大鼠不同腦區(qū)中的水平（，mg/g，n＝6）Tab 4 The levels of NE and 5-HT in different parts of brain in rat（s，mg/g，n＝6）

表4 NE、5-HT在大鼠不同腦區(qū)中的水平（，mg/g，n＝6）Tab 4 The levels of NE and 5-HT in different parts of brain in rat（s，mg/g，n＝6）

被測物NE 5-HT嗅球0.864±0.100.086±0.04大腦皮層0.411±0.120.383±0.21小腦0.343±0.140.059±0.04海馬1.654±0.800.135±0.09下丘腦3.062±1.510.206±0.12

由表4結(jié)果可知，NE在下丘腦中含量最高，海馬次之，小腦最低；5-HT在大腦皮層中含量最高，下丘腦次之，小腦最低。說明單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在♀大鼠腦中分布不均一，與張燕等[3]報道一致。

3 討論

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易分解，且腦組織樣品量少，成分復(fù)雜，神經(jīng)遞質(zhì)含量極微。因此建立一套完整、詳細、可重復(fù)的含量分析方法尤為重要。

根據(jù)文獻[4-7]，筆者先后進行了4種不同流動相[（1）緩沖鹽溶液（無水乙酸鈉2.0 g、檸檬酸5.5 g、EDTA-2Na 60 mg、NaCl 584.4 mg、1.0 mmol/L庚烷磺酸鈉2 ml制成500 ml）-甲醇（97∶3）；（2）緩沖鹽溶液（0.1 mol/L磷酸二氫鉀、0.01 mol/L庚烷磺酸鈉、0.1 mol/L EDTA-2Na，用0.1 mol/L磷酸調(diào)pH為3.6）-甲醇-乙腈（78∶19∶3）；（3）緩沖鹽溶液（0.1 mol/L磷酸二氫鈉、0.85 mmol/L庚烷磺酸鈉、0.5 mmol/L EDTA-2Na，用0.1 mol/L磷酸調(diào)pH為3.4）-甲醇（94∶6）；（4）“2.2”項下流動相]的實驗摸索。前3種流動相出現(xiàn)了NE峰未能有效分離或者5-HT峰有明顯拖尾現(xiàn)象的現(xiàn)象，最終確定采用“2.2”項下流動相。結(jié)果表明，在此流動相條件下，NE、5-HT及內(nèi)標均可達到有效的分離。實驗發(fā)現(xiàn)，增大甲醇的比例不改變各物質(zhì)的出峰順序，而且可以明顯縮短各物質(zhì)的保留時間，尤其是對5-HT影響較大，但甲醇比例過大多會使NE出峰過早，與雜質(zhì)峰重疊，影響分析結(jié)果。于是筆者改變了以往文獻等度洗脫的方法，采用梯度洗脫，既可使各物質(zhì)保持良好的分離度，又可以縮短5-HT的保留時間。

在標準品溶液稀釋液的選擇上，本實驗分別考察了蛋白沉淀液、0.1 mol/L HCl以及流動相，發(fā)現(xiàn)采用流動相及HCl后色譜峰干擾大，因此，最終確定標準品溶液稀釋液為蛋白沉淀液。

多數(shù)文獻選用0.1 mol/L的高氯酸作為蛋白沉淀液，因其除蛋白質(zhì)峰效果最好、雜質(zhì)最少，但未明確加入量。若蛋白沉淀液加入過多，會使峰形過于低平，且高氯酸濃度過高會引起神經(jīng)遞質(zhì)氧化分解；若加入過少，蛋白質(zhì)會對峰形產(chǎn)生干擾或無法勻漿。經(jīng)過反復(fù)試驗，確定加入比例為:＞100 mg的組織按1 mg ∶2.5 μl的比例加入，＜100 mg的組織按200 μl加入。這樣既能有效沉淀蛋白，又不干擾峰形。

在操作過程中應(yīng)盡量避光及在冰水浴中低溫下操作。樣品經(jīng)前處理后應(yīng)立即檢測或分裝保存在－80℃的冰箱中。含量分析時，如果具備進樣器控溫模塊，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)至4℃為佳；如無此模塊，則NE在常溫下至少能穩(wěn)定3 d，而5-HT只能穩(wěn)定1 d。

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