黃道秋，牟華明，秦旭華，彭騰，萬維海，賀元元，楊力（1.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000；.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 61007）

痛經(jīng)亦稱經(jīng)行腹痛，是婦科臨床常見多發(fā)病，嚴(yán)重影響廣大婦女正常的學(xué)習(xí)、工作和生活。對(duì)于此癥西醫(yī)并無特效治療方法，常用的非甾體抗炎藥可引起消化道潰瘍，其發(fā)生率為15%～30%，其次為肝腎損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國每年大約有107000例由非甾體抗炎藥引起的嚴(yán)重消化道損傷和16500例與非甾體抗炎藥相關(guān)的死亡[2]。中醫(yī)學(xué)在本病的治療方面有著悠久的歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)傳統(tǒng)中藥具有療效好、副作用少的特點(diǎn)[3]。因此，對(duì)痛經(jīng)經(jīng)驗(yàn)方芩術(shù)四物湯進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究不僅是中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的需要，更是臨床的迫切需求。本研究采用有機(jī)溶劑系統(tǒng)分離提取法，將芩術(shù)四物湯分為乙酸乙酯、正丁醇、水提取物，以縮宮素復(fù)制小鼠痛經(jīng)模型為對(duì)象，初步確定芩術(shù)四物湯治療痛經(jīng)的有效部位；在此基礎(chǔ)上對(duì)其有效部位再次進(jìn)行分離提取，通過藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選其有效成分。

1 材料

1.1 儀器

DSY-1-2型電熱恒溫水浴鍋（北京國華醫(yī)療器械廠）；SHB-Ⅸ型循環(huán)水式多用真控泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；BUG25-12型超聲波清洗器（必能信超聲上海有限公司）；FA2004 N型電子天平（上海民怡儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物、漢黃芩素、黃芩素、沒食子酸、黃芩苷均由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室彭騰副教授提供；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號(hào):20130208）；縮宮素注射液（河南輔仁懷慶堂制藥有限公司，批號(hào):20121217）；布洛芬膠囊（中美天津史克制藥有限公司，批號(hào):09100248）；前列環(huán)素（PGF）2 α測(cè)試盒（美國Sigma公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM種小鼠，♀，體質(zhì)量18～22 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào):SCXK（川）2008-11]。

2 方法

2.1 芩術(shù)四物湯提取物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響

[4-5]方法，將小鼠ig己烯雌酚（2mg/kg），每天1次，連續(xù)12 d，人工促使其處于動(dòng)情期或動(dòng)情前期，以提高小鼠子宮平滑肌對(duì)縮宮素的敏感性，末次ig己烯雌酚60min后ip縮宮素20 u/kg以復(fù)制小鼠痛經(jīng)模型。80只小鼠隨機(jī)均分為8組，即模型（等容含0.5%吐溫80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物高、低劑量（230、120mg/kg）組，芩術(shù)四物湯正丁醇提取物高、低劑量（1040、520mg/kg）組，芩術(shù)四物湯水提取物高、低劑量（3000、1500mg/kg）組。ig己烯雌酚第6天時(shí)開始ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。觀察ip縮宮素30min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，并計(jì)算抑制率。抑制率%＝（模型組扭體反應(yīng)次數(shù)－給藥組扭體反應(yīng)次數(shù)）/模型組扭體反應(yīng)次數(shù)。

2.2 芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響

復(fù)制模型同“2.1”項(xiàng)下方法。100只小鼠隨機(jī)均分為10組，即模型（等容含0.5%吐溫-80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，漢黃芩素高、低劑量（134、67mg/kg）組，黃芩素高、低劑量（144、72mg/kg）組，沒食子酸高、低劑量（68.6、34.3mg/kg）組，黃芩苷高、低劑量（120、60mg/kg）組。給藥方法與測(cè)定指標(biāo)同“2.1”項(xiàng)下方法。

2.3 沒食子酸與黃芩苷對(duì)模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響

小鼠ig己烯雌酚（2mg/kg），每天1次，連續(xù)12 d，人工促使其處于動(dòng)情期或動(dòng)情前期，以提高小鼠子宮平滑肌對(duì)PGFα的敏感性，末次ig己烯雌酚60min后ip PGF2 a 1.3mg/kg以復(fù)制小鼠痛經(jīng)模型。80只小鼠隨機(jī)均分為8組，即模型（等容含0.5%吐溫80的蒸餾水）組，布洛芬（180mg/kg）組，沒食子酸高、中、低劑量（68.6、34.3、17.2mg/kg）組，黃芩苷高、中、低劑量（120、60、30mg/kg）組。給藥方法與測(cè)定指標(biāo)同“2.1”項(xiàng)下方法。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 芩術(shù)四物湯提取物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響

與模型組比較，芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物高、低劑量組與芩術(shù)四物湯正丁醇提取物高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），表明芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物抑制痛經(jīng)作用較強(qiáng)。芩術(shù)四物湯提取物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響見表1。

表1 芩術(shù)四物湯提取物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of different extracts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by Oxytocin）mice（，n＝10）

表1 芩術(shù)四物湯提取物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of different extracts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by Oxytocin）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

70.04＊＊59.73＊＊48.67＊50.10＊28.3223.0133.19組別模型組布洛芬組芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物高劑量組芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物低劑量組芩術(shù)四物湯正丁醇提取物高劑量組芩術(shù)四物湯正丁醇提取物低劑量組芩術(shù)四物湯水提取物高劑量組芩術(shù)四物湯水提取物低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%180230120104052030001500扭體次數(shù)，次/30mi n 22.6±9.36.7±6.8＊＊9.1±7.3＊＊11.6±8.8＊10.6±8.7＊16.2±10.917.4±10.615.1±7.6

3.2 芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響

與模型組比較，沒食子酸高、低劑量組與黃芪苷高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明沒食子酸、黃芩苷抑制痛經(jīng)作用較強(qiáng)。芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響見表2。

表2 芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ethyl acetate parts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by oxytocin）mice（，n＝10）

表2 芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物中單體化合物對(duì)模型小鼠（縮宮素誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 2 Effect of ethyl acetate parts of Qinshu siwutang of writhing response in mode（linduced by oxytocin）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

組別模型組布洛芬組漢黃芩素高劑量組漢黃芩素低劑量組黃芩素高劑量組黃芩素低劑量組沒食子酸高劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%57.13＊9.3541.0614.6319.1151.63＊45.53＊50.00＊31.71180134671447268.634.312060扭體次數(shù)，次/30mi n 24.6±10.110.5±6.8＊22.3±15.814.5±6.521.0±9.019.9±11.211.9±9.8＊13.4±6.5＊12.3±8.7＊16.8±12.3

3.3 沒食子酸與黃芩苷對(duì)模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應(yīng)的

影響與模型組比較，沒食子酸高、中劑量組與黃芩苷高、中劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，抑制率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。沒食子酸與黃芩苷對(duì)模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響見表3。

表3 沒食子酸與黃芩苷對(duì)模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of gallic acid and baicalin of writhing response in model（induced by PGF2 a）mice（，n＝10）

表3 沒食子酸與黃芩苷對(duì)模型小鼠（PGF2 a誘發(fā)）扭體反應(yīng)的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of gallic acid and baicalin of writhing response in model（induced by PGF2 a）mice（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05vs.model group:＊P＜0.05

組別模型組布洛芬組沒食子酸高劑量組沒食子酸中劑量組沒食子酸低劑量組黃芩苷高劑量組黃芩苷中劑量組黃芩苷低劑量組劑量，mg/k g 抑制率，%62.12＊＊58.33＊＊36.87＊16.4247.72＊41.67＊26.2618068.634.317.21206030扭體次數(shù)，次/30mi n 39.6±12.415.0±9.9＊＊16.5±10.0＊＊25.0±11.6＊33.1±16.520.7±12.5＊23.1±8.8＊29.2±14.5

4 討論

芩術(shù)四物湯是多年臨床經(jīng)驗(yàn)的簡(jiǎn)化方，由古方芩術(shù)丸和四物湯裁減方構(gòu)成，由黃芩、白術(shù)、當(dāng)歸、川芎、白芍等藥構(gòu)成。該方藥味精簡(jiǎn)，藥物配伍平和而巧妙，養(yǎng)血活血，行氣利水，寓意深刻，凡證見血虛、血瘀、濕阻、肝郁、脾虛等虛實(shí)夾雜者，均可用之。該方的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效學(xué)研究在國內(nèi)均屬空白，因此開展該方面的實(shí)驗(yàn)研究，不僅有可能進(jìn)一步闡明傳統(tǒng)驗(yàn)方治療痛經(jīng)的現(xiàn)代機(jī)制，通過現(xiàn)代的分離和提取技術(shù)，更有可能從傳統(tǒng)驗(yàn)方中尋找并開發(fā)出新型安全治療痛經(jīng)的有效藥物。

本研究顯示芩術(shù)四物湯乙酸乙酯提取物在230、120mg/kg劑量下，正丁醇提取物在1040mg/kg劑量下，可明顯對(duì)抗縮宮素誘發(fā)的模型小鼠子宮激烈收縮疼痛所致的小鼠扭體反應(yīng)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。通過對(duì)比篩選實(shí)驗(yàn)，可初步認(rèn)為乙酸乙酯部位、正丁醇部位為芩術(shù)四物湯治療痛經(jīng)的有效部位，但乙酸乙酯部位作用更為明顯，在此基礎(chǔ)上對(duì)芩術(shù)四物湯的乙酸乙酯部位進(jìn)一步分離，得到了漢黃芩素、黃芩素、沒食子酸、黃芩苷4個(gè)單體化合物，并再次進(jìn)行藥效學(xué)的對(duì)比篩選。結(jié)果表明，沒食子酸在68.6、34.3mg/kg劑量下，黃芩苷在120mg/kg劑量下，均能明顯減少縮宮素與PGF2 α所致痛經(jīng)小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，芩術(shù)四物湯乙酸乙酯部位的單體成分沒食子酸、黃芩苷可能是其發(fā)揮臨床治療作用的有效成分。近年來研究表明，沒食子酸還具有抗腫瘤作用[6]，在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞癌細(xì)胞素SH-SYSY神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用[7]，同時(shí)具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用[8]；黃芩苷對(duì)人肝癌HepG2.0細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用[9]，對(duì)急性肺損傷大鼠具有保護(hù)作用[10]，上述結(jié)論與本研究結(jié)果一致，可為臨床用藥提供一定參考。

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