白麗淼，黃曉峰，徐寒梅

（1.中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009；2.南京市口腔醫(yī)院病理科，江蘇南京 210008）

新生血管對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是必不可少的［1］。腫瘤的血管新生是一個受到多種因子共同作用的復(fù)雜過程。腫瘤組織內(nèi)血管的增生情況反映了腫瘤誘導(dǎo)血管新生的能力，檢測腫瘤的微血管密度（microvessel density，MVD），作為反映腫瘤血管生長的指標(biāo)，具有重要意義［2］。CD105為一種同源異體細(xì)胞膜糖蛋白，是TGF-β受體復(fù)合物成分之一。有研究表明，CD105可特異性地表達(dá)于高增殖狀態(tài)的血管內(nèi)皮細(xì)胞［3］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）能夠增加血管通透性，促進內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、血管構(gòu)建、遷移，對腫瘤的新生血管生成起著決定性作用，是目前已知最關(guān)鍵的促進血管生成因子［4］。缺氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移的起始因素，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在腫瘤血管的生成過程中起著重要的調(diào)控作用。缺氧通過兩種方式促進血管生成：一方面HIF-1α可直接增加促進血管生長的因子表達(dá)，如促進 VEGF、VEGFR1、IL-8、血管生成素（angiogenin）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血小板源性生長因子（PDGF）的表達(dá)，以促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管生成；另一方面缺氧可降低血管生成抑制因子的活性，為血管新生提供合適的環(huán)境［5］。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多階段性的連續(xù)過程，腫瘤組織在不同時期存在特定的微環(huán)境［6］。而血管在腫瘤生長不同時期是否存在不同的特征尚未見報道。本實驗應(yīng)用免疫組化方法研究了不同體積的HT-29裸鼠移植瘤組織內(nèi) CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表達(dá)情況，以探討腫瘤不同階段的微血管密度和血管相關(guān)因子的表達(dá)，為血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物的合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物及細(xì)胞株 實驗動物為BALB／c裸小鼠，SPF級，5～7周齡，♀，體質(zhì)量（15±2）g，購自常州卡文斯實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2011-0003。人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；青霉素、鏈霉素（美國Amresco公司）；HIF-1α和VEGF一抗均為兔抗人單克隆抗體，CD31和CD105一抗均為鼠抗人單克隆抗體，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒（鼠兔通用）購自Dako公司。

2 方法

2.1 裸鼠移植瘤實驗 復(fù)蘇凍存的HT-29細(xì)胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集生長對數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升2.5×107個細(xì)胞，接種于BALB／c裸小鼠右側(cè)前肢腋部皮下，每只小鼠接種0.2 ml。2周后15只裸鼠全部成瘤。根據(jù)移植瘤生長情況將15只荷瘤裸小鼠按照腫瘤大小分為3組，每組5只。3組移植瘤的大小分別為＜100 mm3、100～300 mm3、＞300 mm3。

2.2 免疫組化檢測 免疫組化采用Envision兩步法。所有標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、3 μm連續(xù)切片、脫蠟，EDTA pH 8.0高溫抗原修復(fù)，滴加相應(yīng)一抗，4℃過夜，PBS洗滌后加二抗37℃孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠進行封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性切片作為陽性對照。

2.3 結(jié)果判定 ①微血管密度的計數(shù)：腫瘤組織中的微血管均染為棕黃色，陽性定位在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。按Weidner法［7］對MVD進行計數(shù)，即先在低倍鏡（×100）下查看整張切片，找到腫瘤組織的微血管密集區(qū)，再在高倍鏡（×200）下選擇5個視野計數(shù)血管數(shù)，取其平均值作為此樣本的MVD值。任何一個被染為棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與相鄰的微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織界限分明，都被認(rèn)為是一個微血管，進行計數(shù)。管腔大于8個細(xì)胞或帶有較厚肌層的血管不計數(shù)；②VEGF表達(dá)的判定：細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃顆粒為陽性表達(dá)，400倍鏡下隨機取5個不同視野，分別計數(shù)整個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，取其比值作為陽性表達(dá)率，5個數(shù)值的平均值作為該樣本的陽性表達(dá)率；③ HIF-1α表達(dá)的判定：陽性表達(dá)于細(xì)胞核，計數(shù)方法同VEGF。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間差異的比較采用配對樣本t檢驗。

Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages（±s，n＝5）

Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages（±s，n＝5）

*P＜0.05，**P＜0.01 G1 vs G2，and G2 vs G3

Group Tumor volume／mm3 CD31-MVD CD105-MVD VEGF expression／% HIF-1αexpression／%G1 ＜100 37.40±4.17 22.80±3.54 26.20±0.83 3.20±2.97 G2 100～300 18.80±1.72** 15.60±1.35* 40.73±6.29** 11.89±1.94**G3 ＞300 14.20±2.23* 10.20±2.48* 13.41±1.20** 80.62±3.47**

Fig 1 Expression of CD31 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

3 結(jié)果

3.1 染色結(jié)果 CD31陽性表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。在腫瘤組織內(nèi)的微血管和大血管上均有表達(dá)，與其他組織可清晰分辨（Fig 1）。CD105也將血管內(nèi)皮細(xì)胞染為棕黃色，與CD31比較，多染色于微小血管上，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列不規(guī)則，與其他組織可清晰分辨。在大血管上染色不明顯，分布不均勻，腫瘤組織的邊緣區(qū)表達(dá)強烈（Fig 2）。VEGF陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在腫瘤組織內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)（Fig 3）。HIF-1α陽性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，染為棕黃色。在腫瘤組織的壞死區(qū)及其邊緣表達(dá)明顯（Fig 4）。

3.2 腫瘤不同階段 CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表達(dá) 從Tab 1可以看出，隨著腫瘤體積的增大：① CD31-MVD值分別為 37.40±4.17、18.80±1.72、14.20±2.23，CD105-MVD值分別為22.80±3.54、15.60±1.35、10.20±2.48。即體積增大，組織內(nèi)微血管密度減小，各組間t檢驗結(jié)果顯示P＜0.05，差異有顯著性；裸鼠移植瘤不同體積時CD31-MVD、CD105-MVD的變化趨勢見Fig 5；②VEGF陽性表達(dá)率先增后減，分別為 26.20% ±0.83%、40.73%±6.29%、13.41%±1.20%。腫瘤體積在100～300 mm3時表達(dá)最多，體積繼續(xù)增大，VEGF的陽性表達(dá)率減??；③ 組織內(nèi)部的壞死程度逐漸加大，HIF-1α的陽性表達(dá)增加，分別為 3.20% ±2.97%、11.89%±1.94%、80.62%±3.47%。特別是在壞死區(qū)域和壞死邊緣區(qū)域，HIF-1α的陽性表達(dá)明顯。裸鼠移植瘤不同體積時VEGF、HIF-1α的陽性表達(dá)變化見Fig 6。

Fig 2 Expression of CD105 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 3 Expression of VEGF for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 4 Expression of HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 5 CD31-MVD and CD105-MVD for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages

4 討論

早在20世紀(jì)初，Goldman就發(fā)現(xiàn)了血管圍繞腫瘤生成的現(xiàn)象。1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與血管生成密不可分。在無血管狀態(tài)下，腫瘤的營養(yǎng)獲得來源于簡單的被動擴散，腫瘤生長直徑不會超過2 mm。新生血管給腫瘤帶來了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并將腫瘤細(xì)胞與循環(huán)系統(tǒng)聯(lián)系到一起，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供機會［8］。腫瘤血管已經(jīng)成為研究的熱點，是最有希望的腫瘤導(dǎo)向治療的靶標(biāo)。

CD105又名 Endoglin，是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）受體復(fù)合物成分之一。定位于人染色體9q34，分子質(zhì)量為180 ku。TGF-β能降低毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的長度，并且可誘導(dǎo)缺乏CD105的內(nèi)皮細(xì)胞死亡。抑制人內(nèi)皮細(xì)胞中CD105蛋白的翻譯，可增強TGF-β對內(nèi)皮細(xì)胞生長和游走的抑制功能，說明CD105可抑制TGF-β的生物學(xué)效應(yīng)［9］。有研究表明，CD105在多種實體瘤上高度表達(dá)，其與病人的生存率和轉(zhuǎn)移率密切相關(guān)。黃小娟等［10］實驗表明，MVD-CD105與組織學(xué)分級、腹水、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。CD105表達(dá)越高，腫瘤組織學(xué)分級越高，腫瘤患者的預(yù)后越差。CD105可優(yōu)先表達(dá)于腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞上，相對于Von Willebrand因子、CD31和CD34更具特異性，對腫瘤血管的診斷具有更高的參考價值［11］。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，CD105的陽性表達(dá)集中在腫瘤的邊緣區(qū)，在移植瘤不同體積時，陽性染色多為單層內(nèi)皮細(xì)胞圍成的管腔。而在移植瘤體積大于300 mm3的樣本中，用CD31標(biāo)記的血管出現(xiàn)分支和大血管。從數(shù)量上比較，HT-29裸鼠移植瘤在不同時期CD105-MVD、CD31-MVD值差異均存在顯著性（P＜0.01）。

腫瘤的血管生成與其所處的微環(huán)境中血管形成因子有關(guān)。VEGF是一種重要的促進血管生成因子。VEGF通過與受體KDR特異性結(jié)合，發(fā)揮其對內(nèi)皮細(xì)胞的促進分化和趨化作用，從而促進血管新生，所以研究腫瘤組織中VEGF的表達(dá)情況具有重要意義。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，不僅腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF，間質(zhì)細(xì)胞也大量表達(dá)。HT-29裸鼠移植瘤在不同體積時，VEGF的表達(dá)量不同。在腫瘤體積小于300 mm3時，VEGF的表達(dá)量較高，當(dāng)腫瘤體積繼續(xù)增大時，VEGF的表達(dá)量減少。所以在腫瘤體積較小時應(yīng)用VEGF抑制劑類抗腫瘤藥物，可能會獲得好的療效。

Fig 6 Expression of VEGF and HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的具有轉(zhuǎn)錄活性的異源二聚體。其中HIF-1β在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，HIF-1α在氧壓正常時被蛋白酶迅速降解，而在缺氧時，其半衰期延長，與HIF-1β結(jié)合成一個完整的HIF-1轉(zhuǎn)錄子，調(diào)控缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，所以HIF-1α為HIF的氧調(diào)節(jié)亞單位［12］。在HT-29裸鼠移植瘤不同瘤體積時檢測HIF-1α的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤體積的增大，腫瘤壞死面積增加，HIF-1α的表達(dá)率升高。在腫瘤組織的壞死區(qū)域及邊緣區(qū)，HIF-1α明顯表達(dá)。腫瘤體積增大，腫瘤組織內(nèi)血管密度減少，供血不足導(dǎo)致組織得不到充足的氧氣和養(yǎng)分，出現(xiàn)缺氧，常規(guī)藥物無法進入組織內(nèi)部，難以達(dá)成治療效果。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移不僅與腫瘤細(xì)胞本身有關(guān)，與其所處的微環(huán)境也密不可分。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在生長過程中，由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等）和細(xì)胞外基質(zhì)等共同組成的腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，是腫瘤生理學(xué)、結(jié)構(gòu)和功能的一個組成部分［13］。從本實驗中我們可以發(fā)現(xiàn)，HT-29裸鼠移植瘤在不同體積時，腫瘤組織內(nèi)各種細(xì)胞因子的表達(dá)情況不同。所以在腫瘤治療時，腫瘤微環(huán)境為一個重要的考量因素。

惡性腫瘤是一個多因素、多基因、多階段的病理過程。在腫瘤不同階段，基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)呈現(xiàn)不同的規(guī)律［14］。只有給予適時的、恰當(dāng)?shù)乃幬镏委?，才能達(dá)到預(yù)期的治療效果。血管抑制劑類藥物雖然在臨床上取得了巨大的成功和銷售利潤，但其開發(fā)歷史相對其他腫瘤化學(xué)治療藥物較短，其藥理學(xué)研究還不夠深入，非常有必要在其臨床藥理或臨床前藥理學(xué)方面進行深入的研究，以便為其更合理使用提供重要參考。在給予血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物時，一定要考慮到腫瘤所處的階段，只有在腫瘤發(fā)生發(fā)展恰當(dāng)?shù)臅r期給予相應(yīng)的、恰當(dāng)?shù)目鼓[瘤藥物治療，才可能達(dá)到預(yù)期的效果。在腫瘤的治療中應(yīng)注意：（1）研究不同腫瘤、腫瘤不同時期的微環(huán)境，從而采取個性化治療方案；（2）以腫瘤的微環(huán)境為靶點，開發(fā)多靶點藥物或多種干預(yù)手段聯(lián)合應(yīng)用，從而取得期待的治療或預(yù)后。本文結(jié)果說明，在腫瘤分化早期，CD31-MVD、CD105-MVD、VEGF的表達(dá)水平高，此時給予相應(yīng)的血管抑制劑治療會收效明顯；在腫瘤分化中晚期，腫瘤組織內(nèi)部缺氧程度增加，HIF-1α過度表達(dá)，此時給予 HIF-1α抑制劑，如p300／CBP抑制劑JG-ODN、sGC刺激劑YC-1、HSP90抑制劑等對于改善組織缺氧狀態(tài)，抑制腫瘤生長和抑制血管生成具有重要意義［15］。

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