趙輝　魏克強(qiáng)

摘 要：在測得Cu2+致克氏原螯蝦96 h LC50的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 mg/L的基礎(chǔ)上，將螯蝦分別暴露于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L的Cu2+溶液中，在暴露24 h、48 h、72 h和96 h后，測定血淋巴ROS和血藍(lán)蛋白含量。結(jié)果表明，螯蝦血淋巴ROS含量呈現(xiàn)先被誘導(dǎo)上升后被抑制的趨勢，Cu2+具有能夠抑制螯蝦血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性氧ROS的能力；血清血藍(lán)蛋白含量先上升而后逐漸趨于穩(wěn)定，最后顯著上升。

關(guān)鍵詞：銅離子（Cu2+）；克氏原螯蝦；ROS；血藍(lán)蛋白

中圖分類號：X174 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-6835（2014）04-0103-02

甲殼動物的免疫防御為非特異性免疫，缺乏高等動植物的特異性免疫功能，利用活性氧作為殺傷分子的氧化性殺菌機(jī)制是甲殼動物一種主要的防御機(jī)制，它主要指吞噬細(xì)胞在吞噬異物或者受刺激活化呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），這個過程就是呼吸爆發(fā)。研究表明，機(jī)體活性氧產(chǎn)生的強(qiáng)弱程度直接反映了血細(xì)胞殺菌功能的強(qiáng)弱。血藍(lán)蛋白是生物體內(nèi)的一種多功能蛋白，甲殼動物血藍(lán)蛋白約占血淋巴蛋白的90%以上。作為一種呼吸蛋白，血藍(lán)蛋白除載氧外還具有酚氧化物酶活性、抗菌肽活性和凝集活性等功能，此外血藍(lán)蛋白還具有轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子、能量儲存等功能。

本實(shí)驗(yàn)以克氏原螯蝦為研究對象，測定了Cu2+脅迫下螯蝦血細(xì)胞呼吸爆發(fā)后血淋巴ROS含量和血淋巴血藍(lán)蛋白含量的變化，探討Cu2+對克氏原螯蝦血淋巴ROS和血藍(lán)蛋白含量的影響，從而為水產(chǎn)品的安全養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），購于太原市五龍口水產(chǎn)批發(fā)市場，體重（20.1±0.5）g，體長（8.7±0.3）cm。實(shí)驗(yàn)前在40 cm×30 cm×20 cm 的玻璃水族箱中馴養(yǎng)1周，馴養(yǎng)水為曝氣2 d以上的自來水，每天不間斷曝氣，每天投放飼料1次，定時換水，實(shí)驗(yàn)前1 d停止喂食。

Cu2+溶液用硫酸銅配制（CuSO4·5H2O，分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠），實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水將CuSO4·5H2O配成質(zhì)量濃度為10 g/L的母液備用。二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購于sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 染毒方法

根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Cu2+致克氏原螯蝦96 h LC50的質(zhì)量濃度為30 mg/L，實(shí)驗(yàn)設(shè)5個質(zhì)量濃度梯度組（質(zhì)量濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L）和一個對照組（質(zhì)量濃度為0 mg/L），處理時間為96 h。采用體外暴露的方法對克氏原螯蝦進(jìn)行Cu2+染毒，每個處理組15只。整個試驗(yàn)階段停止喂食，水溫14～16 ℃。

1.3 采樣及樣品處理

暴露24 h、48 h、72 h、96 h后分別從對照組和處理組中隨機(jī)取出3尾螯蝦，采集血淋巴，用1 mL注射器從螯蝦圍心腔采血，制成抗凝血（抗凝劑∶血=1∶1），其中一部分用于血淋巴ROS含量的測定，另一部分抗凝血制備成血清，在溫度為4 ℃的條件下，5 000 r/ min離心10 min，取出的上清液于-20 ℃的條件下保存，用于血藍(lán)蛋白的測定。

1.4 血淋巴ROS含量測定

血淋巴ROS的測定按照細(xì)胞活性氧（ROS）試劑盒說明書進(jìn)行，組織ROS利用DCFH-DA熒光探針進(jìn)行檢測，取抗凝血190 μL和10 μL物質(zhì)的量濃度為0.1 mmol/L的DCFH-DA溶液加入96孔黑色酶標(biāo)板中，混勻，置于酶標(biāo)儀中37 ℃保溫。30 min后于激發(fā)波長485 nm，在發(fā)射波長538 nm的條件下檢測熒光強(qiáng)度，結(jié)果以突光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。

1.5 血清血藍(lán)蛋白含量測定

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Cu2+暴露對螯蝦血淋巴ROS含量的影響

不同濃度Cu2+脅迫下螯蝦血淋巴ROS含量隨時間的變化如圖1所示，經(jīng)硫酸銅處理24 h后，Cu2+質(zhì)量濃度為3.0 mg/L時，ROS含量達(dá)到最大值。與對照組相比極顯著升高（P<0.01），Cu2+質(zhì)量濃度為5.0 mg/L，與對照組相比ROS含量顯著升高（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異；銅暴露48 h、72 h和96 h后，隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高，ROS含量逐漸下降。銅暴露48 h后，Cu2+質(zhì)量濃度為1.0 mg/L和10.0 mg/L，ROS含量與對照組相比極顯著降低（P<0.01），質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的處理組ROS含量與對照組相比顯著降低（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異。銅暴露72 h后，當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L時，ROS含量與對照組相比顯著降低（P<0.05），其余處理組與對照組相比無顯著差異。銅暴露96 h后，各處理組ROS含量均低于對照組，但與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

3.1 Cu2+脅迫對螯蝦血淋巴ROS含量的影響

重金屬等環(huán)境污染物進(jìn)入生物體內(nèi)，能夠引起機(jī)體一系列的生理生化反應(yīng)，對于沒有特異性免疫功能的甲殼動物來說，吞噬作用在機(jī)體的防御機(jī)制中起著舉足輕重的作用。血細(xì)胞吞噬作用的主要機(jī)制之一就是伴隨著呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的活性氧ROS，從而導(dǎo)致機(jī)體的氧化損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Cu2+暴露24 h后，螯蝦血淋巴ROS含量顯著升高，3.0 mg/L的處理組表現(xiàn)為極顯著升高。48～72 h期間，所有處理組的ROS含量均顯著下降，低于對照組的含量。染毒96 h后，螯蝦血淋巴ROS含量逐漸趨于穩(wěn)定，各處理組ROS含量低于對照組，但與對照組相比無顯著差異。王寶杰等的研究明，Cu2+對對蝦血細(xì)胞產(chǎn)生活性氧ROS的能力具有不同程度的抑制作用，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符。張峰等的研究表明，重金屬能夠抑制皺紋盤鮑血細(xì)胞吞噬活動中的活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而且這種抑制作用隨著重金屬濃度的增加而加強(qiáng)。

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍(lán)蛋白含量的影響

血藍(lán)蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機(jī)體狀態(tài)和其他環(huán)境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍(lán)蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍(lán)蛋白含量趨于穩(wěn)定，暴露72 h和96 h后，血藍(lán)蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環(huán)境因素的脅迫后，血藍(lán)蛋白含量顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍(lán)蛋白的含量也會發(fā)生顯著的變化。

參考文獻(xiàn)

[1]孫敬鋒，吳信忠.貝類血細(xì)胞及其免疫功能研究進(jìn)展[J].水生生物學(xué)報，2006，30（5）：601-607.

[2]Horan T D，English D，Mcpherson T A. Association of neutrophil chemiluminescence with microbicidal activity[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1982，22（2）：259-269.

[3]Djangmah J S. The effect of feeding and starvation on copper in the blood and hepatopancreas and on blood protein of Crangon vulgaris （Fabricius）[J].Comp Biochem Physiol，1970，32：709-731.

[4]曹偵，馮廣朋，莊平，等.長江口中華絨螯蟹放流親蟹對環(huán)境的生理適應(yīng)[J].水生生物學(xué)報，2013，37（1）：34-41.

[5]Chen J C，Cheng S Y.Hemolymph oxygen content， oxy-hemocyanin，protein levels and ammonia excretion in the shrimp penaeus monodon exposed to ambient nitrite[J].Journal of Comparative Physiology，1995，164（7）：53 0-535.

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[7]張峰，李光友.幾種重金屬對皺紋盤鮑血細(xì)活性氧產(chǎn)生的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué)，2005，24（1）：32-34.

[8]張亞娟，劉存歧，王軍霞，等.氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮對日本沼蝦血細(xì)胞數(shù)量及血藍(lán)蛋白含量的影響[J].四川動物，2008，27（5）：853-854.

[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍(lán)蛋白含量的變化[J].淮南師范學(xué)院學(xué)報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強(qiáng)〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍(lán)蛋白含量的影響

血藍(lán)蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機(jī)體狀態(tài)和其他環(huán)境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍(lán)蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍(lán)蛋白含量趨于穩(wěn)定，暴露72 h和96 h后，血藍(lán)蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環(huán)境因素的脅迫后，血藍(lán)蛋白含量顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍(lán)蛋白的含量也會發(fā)生顯著的變化。

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[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍(lán)蛋白含量的變化[J].淮南師范學(xué)院學(xué)報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強(qiáng)〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin

3.2 Cu2+脅迫對螯蝦血清血藍(lán)蛋白含量的影響

血藍(lán)蛋白是甲殼動物血淋巴中一種含銅的呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色，其含量容易受到各種因素的影響，比如溫度、pH值、機(jī)體狀態(tài)和其他環(huán)境因子等。Cu2+暴露24 h后，各處理組的血藍(lán)蛋白含量均高于對照組；暴露48 h時，各組的血藍(lán)蛋白含量趨于穩(wěn)定，暴露72 h和96 h后，血藍(lán)蛋白含量顯著上升。張亞娟等研究表明，日本沼蝦在受到環(huán)境因素的脅迫后，血藍(lán)蛋白含量顯著升高，與本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果一致。中華絨鰲蟹在從淡水過渡到咸水中時，血藍(lán)蛋白的含量也會發(fā)生顯著的變化。

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[9]王順昌，許立.不同鹽度下中華絨鰲蟹血清總蛋白和血藍(lán)蛋白含量的變化[J].淮南師范學(xué)院學(xué)報，2003，5（19）：24-26.

〔編輯：陳文強(qiáng)〕

Abstract： Measured Cu2 +-induced Procambarus shrimp 96 h LC50 mass fraction of 30 mg / base L， based on the crayfish were exposed to the mass fraction of 0 mg / L， 0.5 mg / L， 1.0 mg / L， 3.0 mg / L， 5.0 mg / L， 10.0 mg / L of Cu2 + solution， exposed 24 h， 48 h， 72 h and 96 h after the determination of ROS and hemolymph hemocyanin content. The results showed that crayfish hemolymph was induced ROS levels rise after first showing inhibition trend， Cu2 + has the ability to be able to suppress the crayfish blood lymphocytes of reactive oxygen species ROS； serum hemocyanin increased first and then gradually stabilized， finally increased significantly.

Key words： copper ions（Cu2 +）； procambarus shrimp； ROS； hemocyanin