單武林，章成芳，馬筱玲，常文嬌，戴媛媛

白血病是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見疾?。?］。由于傳統(tǒng)的化療藥物治療一般伴有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)而不能達(dá)到有效的治療作用。所以，新型抗腫瘤藥物的研發(fā)依舊是目前研究的熱點(diǎn)［2］。盡管人白血病細(xì)胞能夠在體外分離并用于研究，但是仍有許多問題需要通過體內(nèi)試驗(yàn)來驗(yàn)證。因此，建立一個(gè)穩(wěn)定的動物模型用于新型抗白血病藥物的研究具有重要意義［3］。自從1983年美國學(xué)者Bosma發(fā)現(xiàn)SCID小鼠以來，人們便將這類小鼠廣泛用于白血病的研究。大量的研究［4－6］表明人白血病細(xì)胞可在這類小鼠體內(nèi)廣泛生長并擴(kuò)散。通常主要采用以下幾種方法構(gòu)建小鼠白血病模型，主要包括:皮下、腹腔和靜脈注射［4，7－8］。該研究選擇皮下及腹腔2種途徑接種構(gòu)建HL-60白血病小鼠模型，并進(jìn)一步比較兩種模型的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(100 U/ml青霉素 G、100 μg/ml鏈霉素和 2 g/L 碳酸氫鈉)培養(yǎng)，并置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SCID小鼠，雄性，清潔級，體重17～20 g，3～4周齡(購于北京華阜康公司)，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)清潔級實(shí)驗(yàn)動物房帶蓋鼠盒中(符合SPF標(biāo)準(zhǔn))。室內(nèi)空氣經(jīng)有效過濾。飲用水酸化處理pH 4～5。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，墊料及一切與鼠接觸物品均滅菌處理。

1.1.3 主要試劑 小鼠抗人CD33單抗購于美國BIOSS公司;紅細(xì)胞裂解液購于加拿大Stem Cell Technologies公司;抗人CD33-PE標(biāo)記和陰性對照羊抗小鼠IgG-PE標(biāo)記購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 急性髓系白血病SCID小鼠模型的建立SCID小鼠于移植前連續(xù)2 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX，100 mg/kg體重)。第2次注射CTX 24 h以后，將小鼠隨機(jī)分為A、B和C 3組，每組8只。取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，分別以右側(cè)腹部皮下單點(diǎn)注射(A組)1×107/鼠，腹腔注射(B組)1×107/鼠接種于小鼠。C組小鼠不做處理作正常對照。如果小鼠出現(xiàn)以下癥狀將其處死，包括:下肢癱瘓;體重下降＞20%;小鼠縮成一團(tuán);垂死的狀態(tài)。

1.2.2 外周血白細(xì)胞及分類計(jì)數(shù) 接種細(xì)胞后，每周取尾靜脈血檢測。采用人工法計(jì)數(shù)外周血白細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 病理和免疫組織化學(xué)檢查 瀕死動物進(jìn)行病理檢查，取肝和脾，以10%甲醛固定48 h以上，常規(guī)石蠟切片，HE染色后鏡檢。免疫組化檢測:石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水，抗原熱修復(fù)后，加小鼠抗人CD33單抗，生物素標(biāo)山羊抗小鼠IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素。

1.2.4 流式細(xì)胞分析儀檢測CD33陽性率 CD33為一跨膜糖蛋白，在HL-60細(xì)胞上，CD33表達(dá)陽性率可達(dá)99%。CD33陽性率可作為模型腫瘤浸潤的重要指標(biāo)。取瀕死小鼠外周血，紅細(xì)胞裂解液去除外周血中的紅細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液備用。另取肝脾組織，制備組織單細(xì)胞懸液備用。將處理完畢的單細(xì)胞懸液加抗人CD33-PE，陰性對照羊抗小鼠IgGPE標(biāo)記，4℃避光染色30 min，再經(jīng)PBS洗2次，上流式細(xì)胞儀(FAcscan，美國BD)。Cell quest軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0和Photoshop軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組生存分析采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HL-60白血病SCID小鼠模型 兩種接種方法都能夠成功構(gòu)建小鼠白血病模型。在A組，所有小鼠在16 d內(nèi)形成了肉眼可見的皮下腫瘤，平均成瘤時(shí)間為(12.15±3.26)d;所有小鼠在66 d內(nèi)死亡，平均生存時(shí)間為(53.24±10.33)d。在B組，6只小鼠在25 d內(nèi)形成了肉眼可見的腹腔腫瘤，平均成瘤時(shí)間為(19.00±5.84)d;這6只小鼠在53 d內(nèi)全部死亡，平均生存時(shí)間為(36.87±10.22)d。見圖1。另外2只沒有形成腹腔腫瘤的小鼠沒有死亡。形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)B組小鼠肝脾腫大較A組小鼠明顯。另外，B組小鼠腹腔形成腹水，而A組沒有腹水形成。

圖1 兩組小鼠的生存曲線

2.2 小鼠外周血和臟器中腫瘤浸潤情況 接種細(xì)胞后，每周取尾靜脈血檢測外周血白細(xì)胞數(shù)。在同一時(shí)間，A、B兩組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)高于C組，且B組小鼠白細(xì)胞數(shù)升高比A組快。從第4周開始，B組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)較A、C兩組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.53，P ＜0.05)，見表1。流式檢測結(jié)果顯示兩組小鼠外周血均有白血病細(xì)胞浸潤，但是比例較低，不超過3%。A、B兩組小鼠外周血中白血病細(xì)胞平均比例分別為(1.72±1.07)%和(2.65±1.36)%，見圖4。HE和免疫組織化學(xué)用于檢測肝脾腫瘤浸潤情況。B組小鼠臟器浸潤比A組嚴(yán)重。B組小鼠的肝脾都有大量白血病細(xì)胞浸潤并伴隨著結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重破壞。在A組中，脾有白血病細(xì)胞并伴隨著結(jié)構(gòu)的破壞，然而肝臟很少能檢測到白血病細(xì)胞浸潤且?guī)缀鯔z測不到結(jié)構(gòu)的破壞，見圖2、3。另外，采用流式檢測肝脾單細(xì)胞懸液中CD33陽性的白血病細(xì)胞比例。A組小鼠肝、脾白血病細(xì)胞比例為(1.83±1.15)%和(8.54±3.79)%，B組小鼠肝、脾白血病細(xì)胞比例為(6.93±3.15)%和(12.16±4.63)%，見圖4。流式結(jié)果進(jìn)一步證明了B組小鼠臟器浸潤破壞較A組明顯。

3 討論

白血病是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病，克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段［9］。近年來，盡管在白血病治療方面有了很大進(jìn)步，但治療效果及預(yù)后并不理想［10］。探索新的、更加經(jīng)濟(jì)、有效的靶向治療方法是臨床醫(yī)學(xué)的迫切需要。新型治療藥物需要在動物模型中驗(yàn)證其生物學(xué)效應(yīng)。因此，需要建立穩(wěn)定的動物模型用于新型藥物抗白血病研究。

本研究顯示，兩種接種方法均可成功構(gòu)建HL-60小鼠白血病模型。皮下接種出現(xiàn)肉眼可見的瘤體時(shí)間早于腹腔接種。A組成瘤率為100%，B組成瘤率為75%。以下幾個(gè)因素影響人白血病細(xì)胞成功移植于小鼠體內(nèi)。首先，移植成功率與人白血病細(xì)胞的生物學(xué)特性和細(xì)胞FAB類型有關(guān)。用從小鼠腹水中取出的白血病細(xì)胞接種有較高的移植成功率。因?yàn)楦顾械陌籽〖?xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了小鼠的體內(nèi)環(huán)境，易于其生長擴(kuò)散。M2和M3移植成功率比其他細(xì)胞類型低。Rombouts et al［11］研究發(fā)現(xiàn)M0比M2、M4以及M5移植成功率高。其次，移植成功率與SCID小鼠的特性有關(guān)。SCID小鼠雖然有嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷，但體內(nèi)仍有著自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞、粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞的活性。隨著細(xì)胞周期的延長，其他的免疫活性也會重建［12］。研究［13］顯示對于＞5周齡的小鼠，必須經(jīng)過預(yù)處理來克服或突破剩余的免疫防御系統(tǒng)來提高移植成功率。給予SCID小鼠額外的生長刺激，包括IL-3、IL-6和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子等，能提高白血病細(xì)胞的移植成功率。采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄈコ齋CID小鼠體內(nèi)的NK細(xì)胞也能夠提高移植成功率。另外，白血病細(xì)胞移植成功率與患者預(yù)后有關(guān)。研究［14］表明預(yù)后較差患者的白血病細(xì)胞具有較高的移植成功率。

表13 組小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)(×109/L，±s)

表13 組小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)(×109/L，±s)

與A組比較:*P＜0.05;與C組比較:△P＜0.05;在第7、8周B組小鼠已經(jīng)死亡

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圖2 各組小鼠肝臟HE和免疫組化染色結(jié)果 ×400

圖3 各組小鼠脾HE和免疫組化染色結(jié)果 ×400

圖4 各組小鼠外周血、肝和脾細(xì)胞懸液中白血病細(xì)胞比例

在存活時(shí)間方面，腹腔接種組小鼠存活時(shí)間較皮下注射組短。兩種接種途徑均可引起小鼠外周血白細(xì)胞升高，腹腔接種組外周血白細(xì)胞數(shù)上升速度較皮下接種組快。從接種后第4周開始，兩組之間白細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這也能解釋為什么腹腔接種組小鼠生存時(shí)間比皮下接種組短。兩組小鼠外周血中都檢測到白血病細(xì)胞，但是白血病細(xì)胞的比率較低，不超過3%，這與 Lord et al［15］研究結(jié)果一致。另外，本研究結(jié)果顯示腹腔接種組小鼠臟器浸潤較為嚴(yán)重。

總之，經(jīng)皮下、腹腔兩種途徑接種HL-60細(xì)胞均可成功構(gòu)建小鼠白血病模型。皮下注射成瘤時(shí)間短，存活時(shí)間長，可見明顯的瘤結(jié)節(jié);皮下接種腫瘤細(xì)胞具有操作簡單、重復(fù)性好和易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，因而可通過觀察和測量皮下腫瘤的體積大小和重量，分析藥物抗白血病療效。腹腔注射成瘤時(shí)間長，存活時(shí)間短;利用腹腔接種的方法，可更好的了解白血病細(xì)胞在臟器中的浸潤和轉(zhuǎn)移情況。當(dāng)然，如果希望充分的了解一種藥物的療效，最好同時(shí)采用兩種小鼠模型來檢測其抗白血病作用。

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