羅正亮，李 旭，尚希福

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死主要發(fā)生于30～50歲的成年人，其男女發(fā)病率比約為2.4∶1，是一種慢性的、致殘性的疾病，并最終導致關節(jié)塌陷、繼發(fā)性關節(jié)炎，常需要采用全髖關節(jié)置換術治療［1］。目前公認的發(fā)病因素主要包括:激素、酒精以及某些特發(fā)性因素［2］，然而對于其發(fā)病機制現(xiàn)主要集中在血管內皮細胞活性、骨髓間質干細胞分化能力方面的研究［3－4］。Ezrin 蛋白是 ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白家族成員之一，是膜細胞骨架連接蛋白，其分子長度為585個氨基酸，相對分子質量約為81 ku［5］。目前研究［6－7］表明Ezrin蛋白在維持細胞極性、細胞活性、信號傳導以及增殖、分化和凋亡以及血管生成等方面發(fā)揮重要的調控作用。尚未有相關文獻報道在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中Ezrin是否有特異性改變，該研究旨在初步探討非創(chuàng)傷性股骨頭壞死局部組織中Ezrin表達的變化及其臨床意義，為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的分子調控機制研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2011年10月～2012年12月在安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院骨科行全髖關節(jié)置換術切取的股骨頭標本54例。結合影像學、臨床癥狀診斷明確的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死38例作為實驗組，其中男24例，女14例，年齡29～67歲，平均51歲;按Ficat分期分為Ⅲ期11例，Ⅳ期27例;服用激素者20例，酗酒者11例，原因不明者7例。診斷明確的新鮮股骨頸骨折16例作為對照組，并排除心血管及免疫系統(tǒng)疾患，無服用激素史以及煙酒嗜好患者。股骨頭經冠狀面對半切開后，于壞死區(qū)與健存區(qū)之間的移行區(qū)取材，一部分置于含RNA保存液的凍存管中，然后迅速轉入－80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?，另外一部分?%中性福爾馬林溶液固定，13%乙二酸四乙酸二鈉脫鈣后做成石蠟塊備用。兩組患者的一般臨床特征對比差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 主要試劑 鼠抗人Ezrin單克隆抗體(美國Sigma公司);山羊抗鼠IgG-HRP、SP免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司);逆轉錄－聚合酶鏈反應(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)。Ezrin(431 bp)引物序列:上游5'-CCC TCC AGT TCA AGT TCC-3'，下游 5'-AAG CCA AAG GTC TGT TCC-3';β-actin(252 bp)引物序列:上游5'-ATG GAT GAT GAT ATC GCC GCG CTC-3'，下游5'-TTT CTC CAT GTC GTC CCA GTT GG-3'。引物序列均由上海生物工程公司代為設計與合成。

1.3 實驗方法 采用免疫組化SP法:將石蠟塊制成5 μm厚切片，經65℃ 烤30 min后，二甲苯脫蠟水化，檸檬酸高溫修復抗原，加入鼠抗人Ezrin單克隆抗體(1∶150)工作液，4℃孵育過夜;通用型二抗室溫孵育15 min，DAB顯色;隨后蘇木精復染，酒精梯度脫水、中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。RT-PCR操作如下:取50 mg待測組織，參照TRIzol說明書提取組織RNA，取2 μg RNA進行逆轉錄(RT)及PCR反應。PCR反應擴增條件:95℃預變性5 min;95℃ 30 s、56℃ 45 s、72℃ 60 s，共32個循環(huán);最后于72℃ 延伸10 min。目的基因條帶灰度值與管家基因(β-actin)灰度值的比值用于統(tǒng)計學分析，實驗重復3次。

1.4 結果判定 免疫組化結果的按照評分等級由兩位病理科醫(yī)師分別觀察讀片判定。根據(jù)染色強度和陽性細胞比例分別評分，兩者評分乘積≥4分確定為陽性［8］。染色強度:按切片中細胞染色的深淺，無著色或基本不著色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。陽性細胞比例:每例隨機觀察3個高倍鏡(×400)視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算300個細胞中陽性細胞所占百分比，陽性細胞比例 ＜10%為0分;10% ～25% 為1分;26% ～50% 為2分;51% ～75%為3分;＞75%為4分。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行檢驗分析。檢驗水準為α=0.05，雙側。

2 結果

2.1 Ezrin蛋白在不同組織中的表達情況 免疫組化結果顯示，Ezrin陽性表達呈黃色或棕黃色，定位于細胞質。其中Ezrin蛋白在實驗組中陽性表達12例，對照組中陽性表達10例，實驗組陽性率(12/38)明顯低于對照組(10/16)，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.459，P ＜0.05)。見圖1。

圖1 Ezrin蛋白在不同組織中的表達 IHC×400 A:實驗組;B:對照組

2.2 Ezrin mRNA在不同組織中的表達差異 RTPCR結果分析顯示Ezrin mRNA非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組織中的表達水平為0.65±0.17，而股骨頸骨折組織的表達水平為1.58±0.21，結果顯示Ezrin基因在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組織中的表達水平明顯低于骨頸骨折組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=17.105，P＜0.01)，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測Ezrin mRNA在不同組織中的表達

2.3 Ezrin蛋白的表達與臨床特征間的關系 Ezrin蛋白在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死組織中的表達水平與患者性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、職業(yè)及病因無明顯相關性，但與疾病分期有關(P＜0.05)，見表1。

3 討論

由于骨壞死目前沒有特效的指標藥物，只能延緩病情，而骨壞死患者發(fā)病率較高并呈逐年上升趨勢，并且其發(fā)病機制仍存在爭議。目前提出的假說包括:血管內凝血、脂肪代謝紊亂、骨髓內壓力升高、細胞凋亡、骨質疏松學說等［9］。這些假說雖然側重點各不相同，但主要研究均集中于血管內皮細胞活性及骨髓間質干細胞分化能力，并已證實，在骨壞死部位，血管內皮細胞活性降低、凋亡增加、骨髓干細胞分化能力降低紊亂，造成骨壞死的修復機制受損［3－4］，最終引起股骨頭壞死改變。

表1 實驗組中Ezrin的表達與臨床特征之間的關系

Ezrin首先于1981年在雞的腸上皮絨毛中被發(fā)現(xiàn)，其編碼基因位于染色體6q25-q26［10］?，F(xiàn)已證實Ezrin蛋白以非活化和活化兩種狀態(tài)存在，并且在新血管生成、內皮細胞通透性、細胞凋亡、分化、增殖以及腫瘤轉移的過程均發(fā)揮著重要生物活性作用。Youn et al［11］報道在鈣蛋白酶介導的內皮細胞血管生成機制中，Ezrin、PI3K、Akt、5'-AMP 激活性蛋白激酶這一系列的信號級聯(lián)反應調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)誘導內皮細胞氮氧化物合酶生成eNOS，從而最終發(fā)揮血管生成作用。另外，Kishore et al［12］報道腫瘤壞死因子α(TNF-α)可通過Rho激酶誘導Ezrin活化，活化的Ezrin蛋白進入細胞核與細胞周期素A(cyclin A)的啟動子結合，從而調節(jié)微血管內皮細胞的增殖、血管生成以及滲透性。在細胞凋亡方面，Kuo et al［13］采用基因敲除技術使 Ezrin 表達缺失，導致T淋巴細胞和H9細胞凋亡增加，認為Ezrin能負性調節(jié)死亡誘導信號復合體(death-inducing signal complex，DISC)誘導的細胞凋亡。Ezrin是一種細胞骨架蛋白與細胞膜之間的連接蛋白，使細胞感受細胞內外的應力調節(jié)，從而改變干細胞的分化調節(jié);Titushkin et al［7，14］通過 RNAi敲除骨髓間質干細胞的ERM基因后不僅導致了干細胞的應力調節(jié)發(fā)生變化而且發(fā)現(xiàn)直接損傷了干細胞的成骨、成脂分化能力。另外，Huang et al［15］發(fā)現(xiàn)在類風濕性關節(jié)炎的滑膜組織中，ERM蛋白家族的磷酸化水平增高，使成纖維樣滑膜細胞增殖能力增強，并指出抑制ERM蛋白家族磷酸化可能成為類風濕性關節(jié)炎的一個新治療靶點。本研究顯示，Ezrin蛋白水平和Ezrin mRNA水平在實驗組的表達量均較對照組明顯降低，并且Ezrin蛋白陽性表達水平與性別、年齡、BMI、職業(yè)及病因無關，但與疾病分期有關。因此，筆者認為Ezrin在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中表達可能產生了變化，造成新生血管減少、內皮細胞凋亡增加以及骨髓基質干細胞分化能力降低紊亂，并可能參與非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展。

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