陳 靜，李建生，劉文斌，莢衛(wèi)東，許戈良，馬金良，余繼海，葛勇勝

熱休克蛋白75(Mortalin)是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中克隆出來的一種蛋白，屬于熱休克蛋白70家族成員之一［1］。研究［2－6］顯示，Mortalin 參與細(xì)胞生長周期調(diào)控、外界應(yīng)激和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程，且在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。該研究選取100例原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者的癌組織和癌旁組織及10例正常肝組織，采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，檢測Mortain、波形蛋白 (Vimentin)和微血管密度 (microvessel density，MVD)的表達(dá)情況。同時，選取13例HCC患者凍存的癌組織和癌旁組織，行qPCR和Western blot分析，探討Mortalin在HCC轉(zhuǎn)移中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2007年6月～2010年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院100例HCC患者，男76例，女24例;年齡21～80(56.4±11.4)歲?；颊咝g(shù)前未行化療、介入等輔助治療，且組織經(jīng)病理學(xué)確診。選取10例因外傷行肝部分切除患者的正常肝組織作為對照;選取13例來源于我院肝膽胰外科安徽省重點實驗室標(biāo)本庫的冷凍肝癌患者的癌組織和相應(yīng)的癌旁組織。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Mortain多克隆抗體和兔抗人β-actin抗體購于美國Abcam公司;鼠抗人CD34多克隆抗體、鼠抗人Vimentin多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的通用型二抗和DAB試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;蛋白提取試劑盒購于中國KeyGEN公司;TRIzol購于美國Invitrogen公司;ECL顯影試劑盒購于美國Pierce公司;PVDF膜購于美國Millipore公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo公司;實時定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測 常規(guī)行石蠟切片，厚2 μm。首先，每張片子行HE染色;然后，免疫組化染色按試劑說明書行SP二步法染色。光鏡下計數(shù)和拍照。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒為Mortalin陽性表達(dá);Vimentin蛋白主要表達(dá)在肝癌細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞中，發(fā)生EMT后部分肝癌細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色為Vimentin陽性表達(dá)。染色評估使用半定量計數(shù)法［7］:光鏡100倍下檢查組織染色強度 (0:無;1:弱;2:中;3:強)，然后400倍下檢查腫瘤細(xì)胞陽性染色比例 (0:＜5%;1:5% ～25%;2:26% ～50%;3:51% ～75%;4:＞75%)。把這兩項得分相乘得出最后的評分?！?分為高表達(dá);＜4分為低表達(dá)。通過抗CD34抗體染色血管上皮細(xì)胞，低倍鏡下找到血管最密集的地方，然后200倍下計數(shù)MVD［8］。

1.4 Western blot檢測 按照蛋白提取試劑盒的說明書，制備蛋白標(biāo)本，BCA法測蛋白濃度。取20 μl樣品上樣，使用SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，半干式電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，Mortalin一抗孵育過夜，β-actin二抗室溫孵育2 h。ECL顯影和定影。Mortalin蛋白大小為74 ku;βactin蛋白大小為43 ku。Mortalin相對含量=Mortalin灰度值/β-actin灰度值。

1.5 qPCR檢測 根據(jù) TRIzol使用說明書，提取RNA。采用吸光度比值OD260/OD280測RNA純度和濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。Mortalin的引物序列:正向5'-GAGAGACAGGGGTTGATTTGAC-3'，反向 5'-GCACAGATGAGGAGAGTTCACA-3';內(nèi)參(GAPDH)引物序列:正向5'-AAGGTCATCCCTGAGCTGAAC-3'，反向 5'-ACGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。PCR反應(yīng)條件為95℃ 5 s;60℃ 30 s，40個循環(huán)。Mortalin基因擴增產(chǎn)物大小為96 bp;GAPDH基因擴增產(chǎn)物大小為142 bp?；驍U增產(chǎn)物的相對表達(dá)量以 2－ΔΔCt法計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Mortalin在肝癌、癌旁和正常組織中的的相對表達(dá)量 qPCR法檢測結(jié)果顯示，Mortalin mRNA在肝癌、癌旁和正常組織中相對表達(dá)量為2.18±0.31、0.35±0.14和 0.13±0.05。肝癌組織中的Mortalin相對表達(dá)量明顯高于癌旁和正常組織(t=15.72，P ＜ 0.05;t=20.75，P ＜0.05)。Western blot法分析顯示，Mortalin蛋白在肝癌、癌旁和正常組織中相對表達(dá)量為2.58±0.21、0.22±0.09和0.05±0.02。肝癌組織中的Mortalin相對表達(dá)量明顯高于癌旁和正常組織 (t=39.35，P＜0.05;t=61.73，P ＜0.05)。見圖1。

2.2 不同肝臟組織中各蛋白表達(dá)情況 在100例標(biāo)本中，有77例肝癌組織和19例癌旁組織Mortalin蛋白呈高表達(dá);10例正常肝組織中僅1例Mortalin蛋白呈高表達(dá);肝癌組織中有52例Vimentin蛋白呈高表達(dá);CD34主要在血管上皮細(xì)胞表達(dá)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，肝癌組織中高表達(dá)Mortalin的比率為77%(77/100)顯著高于癌旁組織19%(19/100)和正常組織10%(1/10)(χ2=67.388，P ＜0.01;χ2=16.669，P＜0.01)。見圖2。

2.3 肝癌組織中Mortalin的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 Mortalin的高表達(dá)與肝癌的Edmondson分級、TNM分期和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤大小和甲胎蛋白 (AFP)水平等無關(guān)。Mortalin在低分化的肝癌(Ⅲ+Ⅳ)中的表達(dá)明顯高于中高分化的肝癌 (Ⅰ +Ⅱ)(χ2=4.272，P=0.039);Mortalin在TNMⅠ+Ⅱ期中的表達(dá)顯著低于在Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá) (χ2=8.188，P=0.004)。見圖3。Mortalin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯中的表達(dá)顯著高于無侵襲轉(zhuǎn)移中的表達(dá) (P＜0.05)。見表1。

圖1 癌和癌旁及正常肝組織中Mortalin的表達(dá)情況1:癌組織;2:癌旁組織;3:正常肝組織;A:Western blot法檢測Mortalin蛋白的表達(dá);B:Mortalin蛋白的相對表達(dá)量;C:qPCR法檢測Mortalin mRNA的表達(dá);D:Mortalin mRNA的相對表達(dá)量;與癌組織比較:*P＜0.05

圖2 癌組織HE染色和免疫組織化學(xué)染色

2.4 肝癌組織中Mortalin、Vimentin和MVD的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色檢查顯示，肝癌組織中高表達(dá)Vimentin的比率為52%(52/100)。相關(guān)性分析顯示，肝癌組織中Mortalin的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)存在正相關(guān) (r=0.235，P=0.018)。通過使用CD34抗體染色血管發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Mortalin的肝癌組織有更高的MVD的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(39.4±42.5 vs 29.7±16.9，t=1.630，P=0.106)。

3 討論

圖3 Mortalin蛋白在正常肝組織和不同臨床分期的癌組織中的表達(dá)

表1 癌組織中Mortalin的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系

肝癌是我國較常見的惡性腫瘤之一，肝癌根治術(shù)后患者5年生存率為35%，10年生存率僅為7.2%，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是影響其生存率的主要因素［9］。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中，血管形成和EMT扮演著重要的作用。肝癌是富血管性腫瘤，且微血管生長增加，腫瘤細(xì)胞得以不斷的增殖和轉(zhuǎn)移，通過抗CD34抗體使血管上皮著色，計算MVD［10］;在EMT過程中，上皮細(xì)胞極性的喪失和間質(zhì)特征的獲得為主要特點。上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)降低，使得細(xì)胞之間的連接減弱而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)升高，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［11－12］。

Xie et al［13］發(fā)現(xiàn)，在髓細(xì)胞性白血病中高表達(dá)的Mortalin被看作是一個潛在的治療靶點。Dundas et al［14］研究結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)Mortalin的高表達(dá)與患者預(yù)后不良關(guān)系密切。Yi et al［15］發(fā)現(xiàn)肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)較無復(fù)發(fā)患者Mortalin的表達(dá)是增高的。由臨床病理資料分析得出，肝癌中Mortalin的高表達(dá)與腫瘤的TNM分期及靜脈侵潤密切相關(guān)，但是Mortalin是否參與肝癌及其EMT的發(fā)生、發(fā)展，國內(nèi)外鮮有報道。

為研究Mortalin的表達(dá)和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，首先，通過免疫組織化學(xué)染色研究10例正常組織及100例肝癌和癌旁組織發(fā)現(xiàn)較其他組織，肝癌組織中Mortalin顯著高表達(dá)，且Mortalin的表達(dá)水平與腫瘤Edmondson分級、TNM分期和腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密。然后，對100例肝癌組織進行Mortalin、Vimentin和MVD相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Mortalin的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)有相關(guān)性，而高表達(dá)Mortalin的肝癌組織有更高的MVD的趨勢，由此說明Mortalin不能促進肝癌血管形成，而在肝癌EMT的過程中起到促進作用和對肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有十分重要的意義。

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