王 萌，葉 菁，李 晶，褚云娟，王 欣，陳 芳，劉玲俠，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032)

牙周炎是口腔最常見(jiàn)的疾病，菌斑是誘發(fā)牙周炎的主要原因之一，因此菌斑控制是治療及預(yù)防牙周炎的重要措施。牙周非手術(shù)治療的重點(diǎn)即在于去除菌斑，既有利于牙周組織的愈合，也利于牙周組織正常形態(tài)的恢復(fù)［1］。

目前臨床上最經(jīng)典、常用且療效可靠的基礎(chǔ)治療器械是Gracey手工刮治器，但其對(duì)操作者的要求較高，且操作具有一定難度;而不同技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用則可相互彌補(bǔ)不足，提高療效。如Nd:YAG激光，因其具有一定的滅菌效果［2－3］，且能緩解牙本質(zhì)敏感等癥狀而被視作牙周治療的補(bǔ)充手段。另外，噴砂技術(shù)因能高效去除細(xì)小的牙石及色素也被作為補(bǔ)充手段廣泛應(yīng)用于牙周治療，但由于噴砂砂粒的特性，目前還多應(yīng)用于齦上潔治中。隨著噴砂技術(shù)的發(fā)展以及更光滑細(xì)微砂粒的產(chǎn)生，使齦下噴砂成為可能［4］。

本實(shí)驗(yàn)以新鮮拔除的重度牙周炎患牙為對(duì)象，分別采用單純Gracey手工刮治、手工刮治結(jié)合激光照射、手工刮治結(jié)合齦下噴砂對(duì)根面進(jìn)行處理;通過(guò)觀察3種方式處理后牙根表面的粗糙程度以及牙周膜細(xì)胞在根面粘附、增殖情況的差異，探討不同處理方式對(duì)牙根面生物學(xué)性能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液(Hyclone公司，美國(guó));胰蛋白酶(西安科昊生物工程有限公司);Ⅰ型膠原酶(BETTER公司，美國(guó));DMSO(Sigma公司，美國(guó))MTT(Amresco，美國(guó))。TDZ4－WS低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);WS－CJ－2F型超凈工作臺(tái)(蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司);二氧化碳恒溫孵箱(Thermo Scientific，美國(guó));自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio－tek，美國(guó));Smart Life口腔激光治療機(jī)(DEKA MELA公司，意大利);FT－188齦下潔牙機(jī)(EMS公司，瑞士)。

1.2 樣本制備

1.2.1 離體牙選擇

收集因重度牙周炎拔除的磨牙和前磨牙，用生理鹽水沖洗后，從中選取57個(gè)(前磨牙20個(gè)，磨牙37個(gè))用于實(shí)驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn):①存在齦下牙石;②鄰面牙周袋及附著喪失≥6 mm，X線片示牙槽骨吸收至根尖1/3;③近6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過(guò)牙周治療、未服用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn):①患牙根面有齲壞或缺損;②患有全身性疾病。

1.2.2 分組處理和牙根片制備

取上述57個(gè)離體牙分別在牙根標(biāo)記出處理范圍后，用Gracey刮治器以每個(gè)根面2 min的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間對(duì)所有牙齒根面進(jìn)行刮治處理，要求刮治后的根面無(wú)殘留軟組織及牙石附著，根面平整光滑(肉眼觀察)。將處理后的患牙隨機(jī)分為A、B、C 3組(每組19個(gè))，其中A組不做特殊處理(單純刮治組)作為對(duì)照;B組各牙根面用Nd:YAG激光以20 Hz，100 mJ的能量處理2 min;C組各牙根面以中等能量進(jìn)行噴砂及水流處理5 s。取上述處理完成后的所有牙齒，分別在水冷卻下從鄰面釉牙骨質(zhì)界下2 mm處向根方切取5 mm×5 mm×1 mm的根片，每個(gè)牙選取1片較平整的根片(共57片，每組19片)浸泡于含有青霉素和鏈霉素的雙抗PBS液中，過(guò)夜后干燥、高溫高壓消毒備用。

1.3 各組根片表面形態(tài)學(xué)觀察

分別從每組樣本中各隨機(jī)抽取2片根片，用20 mL/L戊二醛液4℃下固定24 h后，乙醇梯度脫水、干燥、噴金，掃描電鏡下觀察根片表面形態(tài)并拍照。

1.4 各組根片表面粗糙度檢測(cè)

分別從每組樣本中各隨機(jī)抽取2個(gè)根片，每個(gè)根片隨機(jī)選擇3個(gè)點(diǎn)用原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)進(jìn)行檢測(cè);并參照 ISO1302－1992的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組的輪廓算術(shù)平均偏差(Ra)。

1.5 不同根面處理對(duì)PDLC粘附、增殖影響的觀察

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

選取16～25歲健康志愿者(知情同意)因正畸減數(shù)拔除的前磨牙，刮取根中1/3的牙周膜組織用組織塊酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)(用含100 mL/L胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液在37℃、50 mL/L CO2條件下)。每3 d換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代，取生長(zhǎng)良好的4代細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 PDLC在各組根片粘附、增殖情況的觀察

將各組所余的15個(gè)根片分別置24孔培養(yǎng)板中，每孔3片。然后取第4代PDLC用DMEM制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10/mL后，取1 mL接種于24孔板各孔中的根片表面，37℃，50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、6、12 h每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各取2個(gè)根片，PBS漂洗3遍后用20 mmol/L戊二醛液固定(4℃過(guò)夜);然后用掃描電鏡觀察細(xì)胞在根片上的粘附情況。各組所余9個(gè)根片繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)后1、3、5 d每組各取一孔(3個(gè)根片)終止培養(yǎng);用PBS漂洗3遍后，避光條件下于每孔中各加入100μL MTT液(5 mg/mL)和100 μL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng);4 h后棄原液，避光條件下于每孔中各加入1 mL DMSO，室溫下微量震蕩5 min使甲臜結(jié)晶充分溶解，然后從每孔中各吸取200 μL混合液轉(zhuǎn)多至96孔板(每試樣復(fù)5孔)，同時(shí)設(shè)DMSO為調(diào)零孔，用酶標(biāo)儀分別檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)下的OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組的根面形態(tài)比較

掃描電鏡觀察顯示:單純Gracey刮治組的根面有較多玷污層存在，局部可見(jiàn)明顯的劃痕(圖1a);刮治合并激光組的根面玷污層相對(duì)較少，且呈熔融狀較為平整(圖1b);刮治合并噴砂組的根面幾乎無(wú)玷污層，且表面光滑而平整(圖1c)。

圖1 不同處理組根面掃描電鏡照片(×2 500)

2.2 不同處理組的根面粗糙度比較

本實(shí)驗(yàn)以原子力顯微鏡并等效采用ISO1302－1992的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組根面的粗糙度進(jìn)行檢測(cè)(單位nm)。表面粗糙度是指加工表面具有的微小峰谷不平度，因其兩波峰或兩波谷之間的距離(波距)很小(難以用肉眼加以區(qū)別)，屬于微觀幾何形狀誤差通常以輪廓算術(shù)平均偏差Ra評(píng)定粗糙度的大小。結(jié)果顯示:單純 Gracey刮治組的 Ra=(1.4075±0.3827)×102(圖2a);刮治合并激光組的 Ra=(2.2445±0.3930)×102(圖 2b);刮治合并噴砂組的 Ra=(1.2143±0.3136)×102(圖2c)，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖2 各組原子力顯微鏡三維重建圖

2.3 不同根面處理對(duì)PDLC粘附的影響

牙周膜成纖維細(xì)胞接種于不同處理后的根片培養(yǎng)不同時(shí)間后，掃描電鏡觀察顯示:1 h時(shí)3組細(xì)胞均開(kāi)始附著，但均未伸展而呈圓形皺縮狀(圖3a、d、g)。6 h時(shí)，單純刮治組細(xì)胞仍未完全伸展而呈皺縮狀(圖3b);而刮治合并激光、噴砂2組細(xì)胞則已完全伸展，且可見(jiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)突起(圖3e、h)。12 h時(shí)，3組細(xì)胞均充分伸展，其中單純刮治組伸展呈梭形，雖可見(jiàn)明顯的細(xì)胞突起，但未見(jiàn)明顯融合(圖3c);而刮治合并激光、噴砂2組細(xì)胞可見(jiàn)大量的細(xì)胞質(zhì)突起，并融合成片(圖3f、i)。

圖3 各組培養(yǎng)不同時(shí)間后掃描電鏡觀察(×500)

2.4 不同根面處理對(duì)PDLC增殖的影響

MTT法檢測(cè)顯示:牙周膜細(xì)胞在3種方法處理的根片上培養(yǎng)1、3、5 d后，各組細(xì)胞數(shù)量(OD值)均隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸增加，其中刮治合并激光組細(xì)胞增殖最明顯，刮治合并噴砂組次之。單純Gracey刮治組最低;各時(shí)間點(diǎn)各組間兩兩相比，除1 d時(shí)激光組與噴砂組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其他各時(shí)間點(diǎn)3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(圖4)。

圖4 各組培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞增殖情況比較

3 討論

研究表明，牙周炎時(shí)處于牙周袋內(nèi)的患牙根面上附有齦下牙石，且可能會(huì)嵌入表層牙骨質(zhì);同時(shí)，齦下菌斑產(chǎn)生的內(nèi)毒素也會(huì)侵入牙骨質(zhì)的表層。因此，治療牙周炎的患牙時(shí)，除了進(jìn)行常規(guī)的齦上下潔治外，還要進(jìn)行齦下刮治和根面平整術(shù)(subgingival scaling and root planing，SRP)，以去除嵌入牙骨質(zhì)的牙石及受內(nèi)毒素污染的牙骨質(zhì);并使根面平整光滑，以利于牙周膜細(xì)胞的再附著和牙周組織的愈合。

Gracey刮治器已廣泛用于牙周臨床治療中，并處于不可替代的地位。但Gracey手工刮治對(duì)操作者要求較高，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，長(zhǎng)時(shí)間操作可能引起醫(yī)生的疲憊，并使之易患腕管綜合征;同時(shí)在操作過(guò)程中還可能會(huì)造成患者感覺(jué)不適，術(shù)后根面敏感等情況［5］。另外，使用Gracey刮治器進(jìn)行手工刮治時(shí)不僅會(huì)造成牙體硬組織表面的劃痕，這種劃痕很可能成為細(xì)菌再附著的巢地［6］;而且還會(huì)在根面形成玷污層［7－8］。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，單純 Gracey手工刮治組的根面不僅存在較多的玷污層，并且在牙根表面造成了明顯的劃痕。

Nd:YAG的熱效應(yīng)可使蛋白凝固、變性、壞死、汽化，而具有滅菌、消毒的作用［2－3］;并且由激光產(chǎn)生的瞬間高溫作用還可使表面牙骨質(zhì)熔融，使之形成保護(hù)層而封閉牙本質(zhì)小管［9］。雖然Nd:YAG激光照射并不能去除大塊的牙石，因此也無(wú)法替代傳統(tǒng)的手工刮治及根面平整;但在手工刮治后使用激光照射，可有效去除牙周袋內(nèi)殘存的細(xì)菌數(shù)量，并可有效去除根面殘留的玷污層。本實(shí)驗(yàn)中掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，手工刮治合并激光照射時(shí)，其根面殘留的玷污層明顯少于單純手工刮治組。而原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，刮治合并激光組的表面粗糙程度明顯高于其他兩組，其原因可能是:激光的熱效應(yīng)可使表面附著的玷污層汽化，從而使器械造成的根面劃痕更明顯地暴露出來(lái);另外，由于激光光纖的尖端細(xì)小(光纖直徑0.3 mm)，只有光纖尖端與根面接觸部分才能發(fā)生蒸發(fā)汽化作用，因此激光的光纖需要在根面反復(fù)移動(dòng)，在移動(dòng)過(guò)程中，光纖在根面各個(gè)部分的停留時(shí)間可能有所差異，從而造成了根面不同位置激光熱效應(yīng)作用時(shí)間不同，最終導(dǎo)致根面粗糙度增大。有研究認(rèn)為，激光處理后的根面有利于牙周膜細(xì)胞的附著［11－12］，在本實(shí)驗(yàn)中也得到了同樣的結(jié)果。將牙周膜細(xì)胞接種于不同方法處理后的根面進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，1 h時(shí)3組細(xì)胞均未伸展，而呈圓形皺縮樣;6 h后，單純 Gracey刮治組細(xì)胞仍未伸展，而激光組和噴砂組細(xì)胞均已完全伸展，并可見(jiàn)明顯的細(xì)胞突觸;12 h后，單純Gracey刮治組細(xì)胞伸展成梭形，而激光組和噴砂組細(xì)胞充分伸展并連接成片狀結(jié)構(gòu)。MTT法檢測(cè)不同處理方式對(duì)細(xì)胞增殖的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，牙周膜細(xì)胞在3種方法處理后的根片表面培養(yǎng)1、3、5 d后，各組的細(xì)胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間而逐漸增加，其中激光組細(xì)胞增殖最明顯，噴砂組次之，Gracey組最低;各時(shí)間點(diǎn)各組間兩兩相比，除1 d時(shí)激光組與噴砂組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)外，其他各時(shí)間點(diǎn)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。以上結(jié)果提示，根片雖經(jīng)消毒處理后，其表面及牙本質(zhì)小管內(nèi)可能還殘留有內(nèi)毒素，從而影響細(xì)胞的增殖。而激光照射能去除根面和牙本質(zhì)小管內(nèi)殘留的細(xì)菌及其內(nèi)毒素，因此激光組更有利于牙周膜細(xì)胞的增殖。此外，本實(shí)驗(yàn)中齦下噴砂用的是新型噴砂材料，其主要成分甘氨酸(Glycine)具有一定的打磨能力，而不會(huì)過(guò)多破壞牙骨質(zhì)表面的正常結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，齦下噴砂不僅可有效去除刮治后根面殘留的牙石和菌斑，同時(shí)還能起到有效的拋光作用，使根面更加光滑以減少菌斑的再附著［10］。由于噴砂顆粒較小，無(wú)法去除大塊的牙石，不能單獨(dú)作為治療牙周炎的方式，只能作為Gracey手工刮治的補(bǔ)充手段用于根面平整。

本結(jié)果顯示，手工刮治結(jié)合齦下噴砂可顯著降低根面的粗糙程度，并促進(jìn)細(xì)胞在根面的附著;而手工刮治結(jié)合激光照射則能顯著促進(jìn)牙周膜細(xì)胞在牙根表面的附著和增殖。

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