李明偉，李 鵬，陳 博，白 玉，程 庚，薛云鵬，肖 敏，余 擎

(第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西 西安 710032)

位于牙髓組織最外層的成牙本質(zhì)細胞層是整個牙髓組織的外層屏障，其自身的完整性和連續(xù)性是牙髓組織正常發(fā)揮功能的重要前提;而成牙本質(zhì)細胞層的完整性和連續(xù)性建立在完好的細胞連接基礎之上。細胞連接由位于細胞之間頂部的緊密連接及其稍下方的粘附連接所構成［1－2］。組成緊密連接的蛋白主要包括occludins、claudins等跨膜蛋白和位于胞內(nèi)的ZO－1(zona occludens－1)蛋白，上述蛋白可在細胞之間形成致密的環(huán)而阻止異物的侵入［2－3］。粘附連接主要由 cadherins、nectins等蛋白構成，這些蛋白可與細胞內(nèi)的信號蛋白等相互作用，并最終與細胞骨架蛋白相連，從而使其能通過自身調(diào)節(jié)直接影響細胞的狀態(tài)［4］。齲病作為牙體缺損的重要誘因之一，當其發(fā)展到深齲階段而接近成牙本質(zhì)細胞層時，齲損組織中的G－菌所釋放的外膜毒力因子—LPS即可直接影響成牙本質(zhì)細胞的生理功能，并進而影響整個牙髓組織的對外反應。

目前的研究已證實了緊密連接、粘附連接在成牙本質(zhì)細胞的細胞間也有建立，并對其組成蛋白如ZO－1、claudin－1 等的表達定位進行了研究［5－6］。但是當細菌毒力因子LPS作用于成牙本質(zhì)細胞時，其細胞連接的構成有怎樣的改變，目前尚不清楚。有鑒于此，本研究通過觀察LPS在體外條件下對成牙本質(zhì)細胞細胞連接的影響，以期為相關研究奠定前期基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料試劑和設備

成牙本質(zhì)細胞系(日本秋田大學Arany教授惠贈);α－MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Gibco，美國);胎牛血清(FBS);PDTC(碧云天);LPS，兔抗β－actin抗體(Sigma，美國);兔抗 cadherin抗體(santa cruz，美國);Alexa Fluor 680染料標記的山羊抗兔二抗(invitrogen，美國);二氧化碳恒溫孵箱(Thermo，美國);細胞總 RNA提取試劑盒(Omega，美國);反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(大連寶生生物);Real time PCR儀:ABI Prism 7500 Real－Time PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國);odyssey激光成像系統(tǒng)(Gene Company，美國)。

1.2 成牙本質(zhì)細胞的擴增培養(yǎng)及其形態(tài)觀察

取成牙本質(zhì)細胞系(odontoblast－lineage cells，OLCs)接種于含 100 mL/L胎牛血清(FBS)、2 mmol/L谷氨酰胺的α－MEM培養(yǎng)液中，置于含50 mL/L CO2孵箱中37℃恒溫條件下進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后，每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)液，并用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.3 LPS對細胞連接分子mRNA表達影響的觀察

1.3.1 實驗分組和LPS刺激

取OLCs以5×105/孔的密度接種于6孔板，37℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。待細胞生長融合達80%以上時，棄原培養(yǎng)液，并將細胞隨機分為4組;分別加入含LPS終濃度為0 ng/mL(對照組)、10、100、1 000 ng/mL 的 α－MEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 RT－PCR 檢測

分別于上述共同培養(yǎng)后0、0.5、1、2 h各時間點取各組細胞，4℃ PBS沖洗兩遍后，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA;并用反轉錄試劑盒合成cDNA(所有操作步驟均嚴格按產(chǎn)品說明)。然后使用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具設計相關引物，并以cDNA為模板、β－actin作為內(nèi)參，按照TAKARA實時PCR試劑盒步驟用 ABI Prism 7500 Real－Time PCR系統(tǒng)檢測各相關細胞連接ZO－1、occludin、claudin－1以及 E－cadherin mRNA的表達水平。反應體系和條件均嚴格按照產(chǎn)品說明。所用引物由上海生工生物股份有限公司合成，各引物序列如表1所示。

表1 各引物序列

1.4 LPS與PDTC共同作用下對連接蛋白E－cadherin表達影響的觀察

取OLCs以5×105/孔的密度接種于6孔板，37℃、50 mL/L CO2條件下進行培養(yǎng)。待細胞生長融合達80%以上時，棄原培養(yǎng)液，并將細胞隨機分為4組，其中3組加入含LPS終濃度為10 ng/mL的α－MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)0、1、6 h終止培養(yǎng);另一組加入含LPS 10 ng/mL、PDTC 100 μmoL/L的α－MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并于培養(yǎng)后的6 h終止培養(yǎng)。分別取上述不同條件下培養(yǎng)結束后的各組細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清獲得細胞總蛋白，并用BCA法測定總蛋白含量;然后取50 μg總蛋白用SDS－PAGE膠進行電泳分離。電泳后將蛋白質(zhì)轉移至PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，一抗(1∶500稀釋)4℃孵育過夜;二抗孵育后掃描獲取圖像。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用student t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 OLCs的擴增培養(yǎng)及其形態(tài)

本實驗所用的OLCs是一種源自牙胚的永生化細胞系，該細胞具有典型的成纖維樣細胞特征，其形態(tài)呈梭型或多角形，并伴有較長的細胞突起，胞核大而圓(圖1a)。細胞培養(yǎng)至融合后，可呈現(xiàn)明顯的旋渦狀(圖1b)。

圖1 OLC 的形態(tài)學觀察(a.200 μm;b.400 μm)

2.2 LPS對各細胞連接分子mRNA表達水平的影響

不同濃度 LPS與 OLCs共同培養(yǎng) 6 h后RT －PCR檢測顯示，10、100、1 000 ng/mL的 LPS均可使 ZO－1、occludin、claudin－1 和 E－cadherin mRNA的表達水平降低，各濃度組(10～1 000 ng/mL)分別與對照組(0 ng/mL)相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而各濃度組間兩兩相比，上述各細胞連接分子的mRNA表達水平均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，即未呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(圖2)。

然后以10 ng/mL LPS作用組為例，觀察各細胞連接分子的mRNA表達水平發(fā)現(xiàn):claudin－1、occludin、E－cadherin mRNA的表達水平均隨作用時間的延長而逐漸降低，呈明顯的時間依賴性(P＜0.05);而ZO－1 mRNA的表達水平雖也隨時間而逐漸降低，但未表現(xiàn)出明顯的時間依賴性(P＞0.05)(圖3)。結果提示，LPS對細胞連接蛋白的影響是通過對其mRNA水平的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的。

2.3 LPS與 PDTC共同作用對細胞連接蛋白E－cadherin表達的影響

Western blot檢測顯示:單獨用10 ng/mL LPS作用于OLCs時，其細胞粘附分子E－cadherin蛋白的表達隨作用時間的延長而逐漸降低，表明細胞連接受到破壞;當10 ng/mL LPS與100 μmoL/L NF－κB抑制劑(PDTC)共同作用于 OLCs 6 h時，其E－cadherin蛋白的表達水平則較單獨LPS作用6 h組有所提高(圖4)，表明NF－κB參與了LPS對細胞連接的破壞。

圖2 不同濃度LPS對各連接分子mRNA的影響

圖3 LPS作用不同時間對各連接分子mRNA的影響

圖4 LPS和PDTC共同作用對E－cadherin的影響

3 討論

細胞連接作為上皮細胞之間結合的重要結構，具有阻擋異物及毒性物質(zhì)入侵的作用［7］。發(fā)揮屏障作用的細胞連接結構主要是緊密連接和粘附連接。緊密連接在電鏡下表現(xiàn)為高密度細胞融合的阻射條帶，其連接的分子基礎是具有四個跨膜結構域的claudins、occludins跨膜蛋白，以及位于胞內(nèi)的ZO－1結構蛋白［8］。粘附連接是細胞之間較為活躍的連接結構，主要由cadherins、nectins等蛋白組成。其中ZO－1和N－cadherin在細胞粘附連接建立的初始階段即已存在，對細胞連接的建立起著關鍵作用［9］。肺泡上皮細胞是肺泡內(nèi)、外環(huán)境之間針對可吸入顆粒物、病毒等物質(zhì)的屏障性結構，當其細胞連接被破壞時，細胞的功能則會大部分喪失從而導致肺部炎癥［10］。腸上皮細胞之間的緊密連接是阻擋腸腔復合物在細胞間通過的結構性屏障，當其被破壞時則會增加異物的通透，從而造成腸黏膜的損傷［11］。當齲病發(fā)展到一定程度引起牙髓炎時，首先遭到損傷的結構是成牙本質(zhì)細胞層，該層組織在炎癥早期階段可通過牙本質(zhì)再生和成牙本質(zhì)細胞層的重建，而形成修復性牙本質(zhì)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，成牙本質(zhì)細胞在受到LPS刺激的早期，其細胞連接蛋白的表達即開始下調(diào);該結果提示，當G－菌侵及成牙本質(zhì)細胞層時，細胞本身則會發(fā)生結構的調(diào)整和改變，包括細胞連接的改變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞連接蛋白表達水平的降低源于其自身mRNA水平的改變，表明由LPS引起的細胞連接的破壞主要源于細胞整體狀態(tài)的改變;而且這些改變已深入到細胞核內(nèi)部乃至基因轉錄水平。在隨后的實驗中還發(fā)現(xiàn)，當條件培養(yǎng)基(含10 ng/mL LPS)中同時加入 PDTC時，由于PDTC抑制了NF－κB轉錄因子活性，則可使LPS對細胞連接蛋白E－cadherin的抑制作用發(fā)生部分逆轉;表明該過程有轉錄因子NF－κB的參與。綜上所述，LPS作用于成牙本質(zhì)細胞時激活了細胞內(nèi)部的NF－κB路徑，而NF－κB作為一種mRNA轉錄過程中的重要調(diào)節(jié)蛋白，則可通過抑制細胞連接蛋白mRNA的合成而影響細胞連接蛋白的表達水平。

有研究表明，LPS不僅能通過位于細胞膜表面的TLR4受體直接激活胞內(nèi)的NF－κB路徑，從而引起下游相關分子的改變［12－13］。同時還能通過與細胞作用，而引起細胞炎性介質(zhì)(如TNF－α、IL－1β)的釋放［14－16］;而 TNF－α 和 IL－1β 又可通過自身位于細胞膜表面的受體而激活胞內(nèi)的NF－κB信號路徑［17－19］。但是，當 LPS作用于成牙本質(zhì)細胞時，其激活NF－κB路徑的方式是直接激活還是間接激活，或者是兩者的共同作用，還需進一步的實驗證實。

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