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        SSR分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜品種純度快速鑒定中的應(yīng)用研究

        2014-05-18 10:59:54田雅欄吳明生
        種子科技 2014年7期
        關(guān)鍵詞:標(biāo)記技術(shù)純度西瓜

        牛 茜,田雅欄,吳明生

        (1.北京市種子管理站,北京 100088;2.北京市農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

        SSR分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜品種純度快速鑒定中的應(yīng)用研究

        牛 茜1,田雅欄2,吳明生1

        (1.北京市種子管理站,北京 100088;2.北京市農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

        根據(jù)雜交種帶型雙親互補(bǔ)的原則,從10對(duì)西瓜SSR引物中篩選出適合北京市主栽西瓜品種純度鑒定引物,其中品種京欣1號(hào)和京欣3號(hào)可鑒定的引物最多,均達(dá)到6對(duì);京秀和航興天秀1號(hào)可鑒定引物最少,只有兩對(duì)。結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法,利用篩選的引物對(duì)已知純度樣品進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示SSR標(biāo)記能準(zhǔn)確鑒定樣品中混雜的親本種子,可用于西瓜雜交品種純度快速鑒定。

        西瓜;品種純度;SSR;快速鑒定

        西瓜是北京市主要農(nóng)作物,也是京郊農(nóng)業(yè)大力發(fā)展的特色經(jīng)濟(jì)作物之一,在北京常年種植面積達(dá)1萬hm2,因此保障西瓜種子質(zhì)量對(duì)京郊農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。種子純度作為衡量種子質(zhì)量的4項(xiàng)重要指標(biāo)之一,由于缺乏有效快速的室內(nèi)檢測(cè)方法,在質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中很少開展西瓜種子純度鑒定,這也間接影響著西瓜種子質(zhì)量的提高。

        近年來,隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展,利用分子標(biāo)記鑒定農(nóng)作物種子純度成為可能,目前在玉米[1]、水稻[2]等一些作物上取得很好效果,這也為西瓜種子純度快速鑒定提供了新的途徑。本文針對(duì)北京市目前主栽的7個(gè)西瓜品種,利用SSR分子標(biāo)記技術(shù),篩選了可以進(jìn)行純度鑒定的引物,同時(shí)利用篩選的引物對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了純度室內(nèi)快速鑒定。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        京欣1號(hào)、京欣2號(hào)、京欣3號(hào)、京欣無籽1號(hào)、京秀、暑寶和航興天秀1號(hào)7個(gè)西瓜品種及其親本材料,均取自北京市審定農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)樣品庫。

        1.2 生化試劑

        植物新型基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司,PCR所用的10對(duì)SSR引物,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,其余試劑由北京化學(xué)試劑公司提供。

        1.3 DNA提取

        采用熱堿法快速提取。種子去殼后,將種仁放進(jìn)深孔板中,向每個(gè)孔加入150 μL NaOH溶液(0.1 M),蓋膜后將深孔板放在桌面上水平來回?fù)u晃10下,把深孔板放在沸水浴中加熱5 min后加入150 mL Tris-HCl溶液(10 mM、pH2.0),水平來回?fù)u晃10下,上清液即可作為DNA模板用于擴(kuò)增。

        1.4 SSR-PCR

        PCR 擴(kuò) 增 體 系 包 括 MgCl22.5 mol/L、dNTPs 0.15 mol/L、引物0.25 μmol/L、Taq聚合酶0.1U、1×Taq Buffer、基因組DNA 1μL,補(bǔ)水至總體積為10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf PCR儀 (Mastercycler nexus X1)上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序:94℃5 min;94℃30 s,60℃35 s,72℃45 s,38個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min,4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用4.5%變性聚丙烯酰胺或3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        2 結(jié)果分析

        2.1 引物篩選

        采用10對(duì)SSR引物(序列信息見表1)對(duì)7個(gè)西瓜雜交品種組合進(jìn)行篩選,依據(jù)雜交種帶型雙親互補(bǔ)的原則 (如圖1),7個(gè)西瓜品種都篩選出適合其純度鑒定的引物(見表2),其中京欣1號(hào)和京欣3號(hào)的可鑒定引物最多,達(dá)到6對(duì);其次是暑寶,有5對(duì)引物可以鑒定;京秀和航興天秀1號(hào)可鑒定引物最少,只有兩對(duì)。

        10對(duì)引物中,不同的引物鑒定品種純度的能力差異較大,其中引物BVWS01843和BVWS00209能鑒定的品種最多,可以用于5個(gè)品種的鑒定,而引物BVWS00048和BVWS00333可鑒定的品種最少,均為1個(gè)。

        圖1 引物“BVWS00297”篩選的結(jié)果

        表1 10對(duì)SSR引物序列信息

        表2 西瓜品種純度鑒定引物表

        2.2 純度鑒定

        在京欣1號(hào)40粒雜交種樣品中摻入4粒父本和4粒母本,獲得已知純度的待測(cè)樣品。采用熱堿法提取西瓜單粒種子DNA,用互補(bǔ)帶片段大小差異較大的引物BVWS01843對(duì)該樣品進(jìn)行檢測(cè),PCR產(chǎn)物經(jīng)3.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示該引物,能準(zhǔn)確檢測(cè)出摻入的4粒父本和4粒母本種子(如圖2),檢出率達(dá)到100%,與實(shí)際相符,說明篩選的引物可有效鑒別西瓜雜交種與親本,適合西瓜品種純度快速檢測(cè)。

        圖2 利用引物BVWS01843對(duì)京欣1號(hào)樣品純度檢測(cè)結(jié)果(♂:父本,♀:母本)

        3 討論

        種子純度是種子質(zhì)量重要指標(biāo)之一,有效的純度檢測(cè)方法將大大提高種子純度檢測(cè)的效率,對(duì)種子質(zhì)量的進(jìn)一步提高具有重要意義。

        目前西瓜種子室內(nèi)純度檢測(cè)方法主要還是蛋白電泳法,但是該方法并不適合所有品種,而且電泳受環(huán)境影響大,技術(shù)穩(wěn)定性不是很高。

        本研究根據(jù)雙親互補(bǔ)原則,篩選出適合北京地區(qū)主栽西瓜雜交品種純度鑒定引物,可準(zhǔn)確鑒定出樣品中混雜的親本材料。另外,結(jié)合西瓜種仁DNA快速提取方法,可以大大縮短DNA提取時(shí)間,實(shí)現(xiàn)純度樣品的快速、高效鑒定。

        目前單引物鑒定一般適合鑒定樣品中親本材料的污染。如果要鑒定異品種,就需要增加鑒定的引物數(shù)量,而相應(yīng)檢測(cè)工作量就會(huì)成倍增加,因此,下一步將通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立多重引物的擴(kuò)增體系,從而提高純度檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。

        [1]王鳳格,趙久然,郭景倫,等.適于玉米雜交種純度鑒定的SSR核心引物的確定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,15(6):964-969.

        [2]李召華,朱克永,陳祖武,等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].雜交水稻,2006,21(4):11-14,47.

        1005-2690(2014)07-0037-02

        S511

        B

        2014-05-15

        北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目(D131100000413001)。

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