董自星 ，張 娟 ,*，李炳薰 ，堵國成 ，陳 堅 ，李華鐘 ,*

（1.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122;3.江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇無錫 214122;4.江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122）

根據(jù)流行病學和臨床研究的結果，血清膽固醇過多具有誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等眾多心血管疾病的風險，而在許多國家心血管疾病是引起殘疾和死亡的重要因素之一[1]。雖然有許多手段可以治療血膽固醇過多癥，比如藥物，但是高昂的價格和產(chǎn)生的副作用限制了它們的廣泛使用。近年來國內(nèi)外許多研究者證實，口服益生菌及其相關制品可以顯著降低人[2-3]、豬[4]、狗[5]和老鼠[6]等哺乳動物體內(nèi)的血清膽固醇水平。益生菌的降膽固醇作用與它們產(chǎn)生的膽鹽水解酶（bile salt hydrolase, BSH，EC 3.5.1.24）密切相關。該酶能將結合膽鹽水解成游離膽酸和氨基酸。由于游離膽酸的溶解度低于結合膽鹽，它便隨糞便排出體外，這就促進了體內(nèi)的膽固醇從頭合成膽鹽以彌補損失，從而使膽固醇水平降低[7]。目前，商業(yè)化的羅伊氏乳桿菌（加拿大，蒙特利爾，Micropharma公司）已經(jīng)上市。這為治療血膽固醇過多癥提供了一種比較天然的方法，也使膽鹽水解酶活性成為益生菌篩選時的一個必要特征。但也有一些臨床實驗表明益生菌對人體沒有顯著的降膽固醇作用[8-9]，因此引起了一些爭議。但這些益生菌是否產(chǎn)膽鹽水解酶，目前還沒有報道。

目前已在許多微生物中檢測或純化到膽鹽水解酶，包括雙歧桿菌，乳桿菌，梭狀芽孢桿菌，類桿菌和糞腸球菌等[7]。關于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）來源的膽鹽水解酶也有一些報道，主要集中在高產(chǎn)菌株的篩選、克隆表達、生理生化特性、降膽固醇作用等方面，但對其降膽固醇的機理、可溶性表達、食品級表達以及底物結合機制等方面研究少。本文綜述了植物乳桿菌膽鹽水解酶的降膽固醇作用、底物結合機制以及異源表達等方面的研究，對揭示其降膽固醇的機制和開發(fā)相關產(chǎn)品具有重要意義。

1 植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶的研究現(xiàn)狀

1.1 植物乳桿菌的降膽固醇作用

近年來，國內(nèi)外許多研究者已經(jīng)對植物乳桿菌的降膽固醇作用做了體內(nèi)和體外的研究。它們都證明了植物乳桿菌具有顯著的降膽固醇作用。表1列舉了一些體內(nèi)研究的結果，從中可以看出，口服植物乳桿菌能明顯降低動物或人體的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯等的水平，特別是降低低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的比例（LDL-C/HDL-C，冠心病一個重要的風險因素[10]）。其中，不同來源的菌株使哺乳動物體內(nèi)的總膽固醇和不利于人體健康的低密度脂蛋白膽固醇分別降低了 2.5%～33%和7.9%～42%。而口服L. plantarum K25使昆明雄性老鼠體內(nèi)的LDL-C/HDL-C降低了43.8%。但是，也有報道表明一些益生菌對人體沒有明顯的降膽固醇作用，這可能跟菌體的有效劑量和益生元的使用有關[11]。

表1 植物乳桿菌在體內(nèi)的降膽固醇作用Table 1 Cholesterol-lowering effect of different strains of L. plantarum in vivo

注：TC，總膽固醇；LDL-C，低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C，高密度脂蛋白膽固醇；TG，甘油三酯；SC，血清膽固醇。

關于乳酸菌降解膽固醇的機制，目前還沒有定論。主要存在以下幾種觀點：（1）同化吸收，即菌體細胞同化吸收介質(zhì)中的膽固醇，從而降低了膽固醇的含量[18]。（2）共沉淀，膽鹽水解酶使膽鹽脫結合，脫結合的膽鹽的溶解度低于結合膽鹽，它在酸性條件下易與膽固醇形成復合物沉淀下來，導致介質(zhì)中膽固醇含量下降[19]。（3）其他理論。盡管關于確實的機理尚無定論，國內(nèi)外大部分學者認為是同化吸收和共沉淀的共同作用，而且乳酸菌的這種降膽固醇作用與它們產(chǎn)生的膽鹽水解酶密切相關。除了共沉淀，膽鹽水解酶降膽固醇的另一種可能的途徑是：膽鹽水解酶作用后的脫結合膽鹽在大腸內(nèi)不被吸收而隨糞便排出體外，這就促使了膽鹽由膽固醇的從頭合成，從而降低體內(nèi)的膽固醇濃度。

1.2 膽鹽水解酶基因的克隆表達

Christiaens等[20]于1992年第一次報道了植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶基因的克隆。其它來源于植物乳桿菌的膽鹽水解酶基因陸續(xù)被報道。從表2中可以看出，這些植物乳桿菌可以被分為兩大類：一類是只產(chǎn)一種膽鹽水解酶的菌，比如 L. plantarum 80、L. plantarum MBUL90和L. plantarum BBE7等，它們的膽鹽水解酶基因的大小一般為975 bp；另一類是產(chǎn)四種不同大小的同工酶的菌，例如L. plantarum ST-III和 L. plantarum WCFS1等，這可能是基因水平轉移的結果[7]。這四種膽鹽水解酶基因（bsh1，bsh2，bsh3和bsh4）的大小分別為975 bp，1017 bp，987 bp和954 bp，且位于染色體的不同位置，氨基酸相似度從21%到39%。Lambert等[21]敲除L. plantarum WCFS1中膽鹽水解酶基因以后發(fā)現(xiàn)bsh1對膽鹽水解酶的酶活起到主要作用，bsh2，bsh3和bsh4在各菌株間相對保守，具有重要的生理學意義。

黃茜、戰(zhàn)媛媛和我們都發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌對植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶進行異源表達時，它們很容易形成包涵體[22-24]。而其它來源的膽鹽水解酶基因的異源表達則很少有產(chǎn)生包涵體的報道，這可能跟它們之間的基因差異有關。為了提高重組蛋白的可溶性，黃茜等利用MBP融合標簽對BSH進行了融合表達，大幅提高了它的可溶性[25]；戰(zhàn)媛媛等則利用畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)了它的可溶性表達[26]；我們利用雙精氨酸途徑的信號肽實現(xiàn)了它的胞外分泌表達，但表達量不高而且胞內(nèi)還有包涵體[24]。

此外，為了使表達的BSH能作為一種治療血清膽固醇過多癥的藥物或保健品使用，需對它進行食品級的表達，這意味著用于構建重組菌的所有基因工具（包括質(zhì)粒載體，選擇標記和轉化方案等）應完全來自食品微生物。盡管Christiaens等[20]和Lambert等[21]將植物乳桿菌來源的bsh基因分別在野生菌L. plantarum 80和乳酸乳球菌中進行了克隆和表達。但他們所用的質(zhì)粒含有抗生素抗性，因此不是完全食品級的表達。如何實現(xiàn)其食品級過量表達，也是目前亟需解決的問題。

表2 不同植物乳桿菌中膽鹽水解酶基因的遺傳信息Table 2 Genetic information of bsh genes from various strains of L. plantarum

1.3 膽鹽水解酶的酶學性質(zhì)研究

膽鹽水解酶屬于N-末端親核水解酶家族，它們的N端都有半胱氨酸殘基。在蛋白自動水解酶過程中，蛋氨酸脫除后，這個半胱氨酸就成為活性位點，這是 N-末端親核水解酶家族的一個共同特征[7]。膽鹽水解酶通常為胞內(nèi)酶，最適反應pH在5和6之間，對氧氣有些敏感。氧化巰基的試劑如高碘酸鈉、碘乙酸、Hg2+和 Cu2+等能夠強烈抑制膽鹽水解酶的活性[24,33]。而DTT等還原劑能保護酶不被氧化[24]。這些都說明，膽鹽水解酶N-末端半胱氨酸的巰基是催化反應的中心。

膽鹽水解酶差異最大的特性是其底物特異性。膽鹽水解酶的底物是甘氨結合膽鹽和牛磺結合膽鹽，它主要由類固醇核心和甘氨酸/?；撬崦撍s合形成的（圖1）。這兩類膽鹽在人體內(nèi)的比例為3:1[31]。Moser等和McAuliffe等的研究表明，膽鹽水解酶先識別底物的類固醇核部分[34-35]。但是酶反應動力學的結果則顯示BSH優(yōu)先識別底物的氨基酸部位，并且大多數(shù)膽鹽水解酶水解甘氨結合膽鹽的能力大于水解?；墙Y合膽鹽的能力[7]。因此，關于膽鹽水解對底物的識別位點還存在爭議，它可能對類固醇核心和氨基酸基團都有識別作用。

圖1 結合膽鹽的化學結構Fig. 1 Chemical structure of conjugated bile salts

目前的研究也發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶主要偏向于水解酶甘氨結合膽鹽（表3）。而且大多數(shù)產(chǎn)膽鹽水解酶的植物乳桿菌水解甘氨結合膽鹽的能力也明顯高于水解?；墙Y合膽鹽的能力。植物乳桿菌L. plantarum Lp-onlly對兩種底物的水解能力相同，但這是由四種膽鹽水解酶共同作用的結果。此外，進化拓寬了膽鹽水解酶的底物特異性[31]，使它們可以水解不同的底物。為了確定L. plantarum Lp-onlly中每一種膽鹽水解酶的底物特異性，應該分別將它們進行異源表達，然后純化。

膽鹽水解酶的底物特異性差異跟它們的氨基酸序列以及空間結構有關。因此，可以從它們的氨基酸序列和蛋白結構出發(fā)來揭示它們結合底物的機制。目前信息理論法（information-theoretic approach）已廣泛應用于尋找蛋白序列中決定底物特異性的氨基酸殘基[36]。因為只用到蛋白的氨基酸序列，對于那些沒有結構報道的蛋白來說，比如植物來源的膽鹽水解酶，這種方法是研究它們的底物結合機制的不錯選擇。

表3 不同植物乳桿菌或其膽鹽水解酶的底物特異性Table 3 Substrate specificities of BSH proteins or different strains of L. plantarum

2 展望

綜上所述，口服產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株或純酶能顯著降低哺乳動物體內(nèi)的血清膽固醇水平，因此，可以用于治療和預防血清膽固醇過多癥。然而植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶的降膽固醇的機制、異源表達以及底物結合機制等方面還存在爭議。以下幾個方面的研究亟待加強：（1）確定益生菌的降膽固醇的機制，特別是BSH在其中所起到的作用。此外，使益生菌具有降膽固醇作用的有效劑量，以及益生元和益生菌的協(xié)同作用也待于進一步研究；（2）通過共表達分子伴侶，使用低拷貝的質(zhì)粒以及與可溶性的標簽融合表達等方法促進BSH的可溶性表達。而且還可以通過降低誘導溫度等發(fā)酵工程的手段減少包涵體的形成；（3）利用食品級的表達元件，包括食品級的質(zhì)粒、宿主、篩選標記、誘導劑以及轉化方案等，實現(xiàn)BSH的食品級過量表達，為其應用奠定基礎；（4）通過信息理論法等揭示BSH對底物的結合機制，以利于研究其水解產(chǎn)物的最終去向以及血清中次級膽鹽含量的增高是否由它所引起的，從而確定BSH的確切功能；（5）開發(fā)高效降膽固醇的菌株或相關產(chǎn)品，并用它們來控制人體的血清膽固醇水平，這具有很大的應用潛力。

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