劉佳敏，徐華潮

（浙江農(nóng)林大學，浙江 臨安 311300）

星天牛成蟲對楝揮發(fā)性物質的GC-EAD反應

劉佳敏，徐華潮*

（浙江農(nóng)林大學，浙江 臨安 311300）

采用活體植物動態(tài)頂空套袋法與氣質聯(lián)用分析技術，對楝（Melia azedarach）的揮發(fā)性化學物質進行分析，并且利用GC-EAD技術測定了星天牛（Anoplophora chinensis）成蟲對楝揮發(fā)性化學物質的GC-EAD反應，結果表明：楝的揮發(fā)性化學物質有20種，其中含有萜烯類化合物（97.71%）8種，烴類化合物（1.021%）5種，醇類化合物（0.23%）3種，酮類化合物（0.02%）1種；星天牛成蟲的觸角對5種化合物的刺激作用比較敏感，其中對β-蒎烯刺激活性最高，對左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇有較輕微的反應。

星天牛；動態(tài)頂空；揮發(fā)性化學物質；GC-MS；GC-EAD

星天牛（Anoplophora chinensis）屬鞘翅目（Coleptera）天牛科（Cerambycidae），是在我國分布較廣，危害樹木種類較多的一種蛀干性害蟲。既蛀食大樹，也取食幼樹，切斷輸送養(yǎng)分和水分的通道，導致樹木衰弱或死亡[1]。天牛對樹木的危害選擇性很強，不同樹種對天牛危害或忌避或抗或被喜食[2～3]。

能夠引起天牛遠距離行為反應的關鍵物質主要是植物的揮發(fā)性有機物。植物揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds, VOCs）是植物通過次生代謝途徑合成的低沸點、易揮發(fā)的小分子化合物，參與植食性昆蟲行為的調控[4～6]。有研究表明，植物釋放的特定的揮發(fā)性氣味物質能夠對天牛起到引誘的作用[7～9]。

在對星天牛行為和習性的觀察研究中，發(fā)現(xiàn)其成蟲特別喜歡取食楝樹（Melia azedarach）皮作為補充營養(yǎng)，而且成蟲壽命一般可達40 ～ 50 d[10～11]。本文采用動態(tài)頂空套袋采集法收集楝的揮發(fā)性化學物質，結合氣質聯(lián)用儀（GC-MS）分析技術對楝的揮發(fā)性化學物質進行分析，并利用電生理學技術，研究星天牛成蟲對楝植株釋放的揮發(fā)性物質的GC-EAD反應，為篩選出對星天牛具有生物活性的植物源引誘劑奠定理論基礎, 從而為進一步實現(xiàn)對星天牛危害的生態(tài)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

在慈溪市沿海防護林柳樹木段中采集星天牛成蟲300余頭，放置于自然條件下人工飼養(yǎng)，成蟲羽化后收集備用。

1.2 材料與儀器

2年生楝選自慈溪市沿海防護林。大氣采樣儀（QC-1型）；氣相色譜與質譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C GC/MSD）；

1.3 楝揮發(fā)性氣體化學成分的收集與測定

1.3.1 試驗方法 采用動態(tài)頂空套袋采集法收集2年生楝植株自然狀態(tài)下所揮發(fā)的氣體。將聚乙烯塑料袋緊緊的綁在楝樹干上，連接好抽氣泵及填有0.5 cm super-Q吸附劑的玻璃管（7 cm×0.5 cm ID)，用玻璃棉將兩端密封，出氣口與5 cm活性炭的玻璃管（7 cm×1 cm ID）相連。氣流計維持1.5 L/min的平穩(wěn)氣流，采樣設備的所有部件通過硅膠管相連。采樣時間為5 h（10:00－15:00），每個處理5個重復。每個揮發(fā)物樣品用含有以正十二烷（150 ppb）為內標的色譜純正己烷（500 μL）洗脫，洗脫后的樣品保存在－5℃待用。

1.3.2 儀器條件 儀器是氣相色譜與質譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5975C GC/MSD）。載氣是99.999%氦氣，氣流為1.5 mL/min。色譜柱為DB-5MS，60 m×0.25 mm（I.D.）×0.25 μm（film）。每次進樣1 μL，分流比為100：1。升溫程序為：50℃恒溫2 min，然后以10℃/min的速度升溫到250℃，最后250℃恒溫5 min。溶劑延遲2 min。離子源溫度230℃，四極桿150℃。Aux-2進樣口溫度為280℃，前進樣口溫度為250℃，質譜轟擊電壓為70eV，掃描的質量范圍為20 ～ 300，共運行27 min。

1.4 GC-EA D測定

1.4.1 測定方法 GC-EAD實驗在中國科學院動物研究所進行。將星天牛成蟲的觸角沿基部剪下，尖端切除少許后，用導電膠將其橫搭在電極上。每種標樣各取3 μL進樣到氣相色譜中進行GC-EAD分析。試驗用蟲均為活體，此實驗重復5次，GC-EAD色譜圖上的化合物的峰形和保留時間進行詳細對比，從而鑒定具有活性的物質。1.4.2 儀器條件 色譜條件：Agilent 6890N-5973N氣相色譜，色譜柱為DB-5MS，60m (long)×0.25mm (I.D.) ×0.25mm (film)；載氣：氦氣，氣流為1 mL/min；無分流進樣口溫度250℃；程序升溫條件：柱箱起始溫度50℃，保留1min，然后以5℃/min 的升溫速率升到250℃；氫火焰檢測器；觸角電位檢測器。

2 結果分析

2.1 楝揮發(fā)性氣體化學成分分析

分離所得的揮發(fā)性物質化合物，通過檢索Xcalibur軟件（Finnigan）所帶的NIST庫中的圖譜，結合保留時間，進行比較鑒定。分析鑒定結果，從圖1楝揮發(fā)性氣體GC/MS總離子流圖可檢出25個化合物，實際鑒定出20種，其他化合物由于質譜信息量不足無法確定，其中已確定化合物占總檢出量80%。采用色譜面積歸一法分析得到表1，由表1可知揮發(fā)性物質組分中左旋-α-蒎烯相對含量較高，楝揮發(fā)性氣體中（依據(jù)相對含量）已知含有萜烯類化合物（97.71%）8種，烴類化合物（1.021%）5種，醇類化合物（0.23%）3種，酮類化合物（0.02%）1種。主要成分是萜烯類化合物、烴類化合物，含有最多的萜烯類物質是左旋-α-蒎烯，占有89.07%。楝自然狀態(tài)下?lián)]發(fā)性氣體的最主要成分是萜烯類化合物，符合揮發(fā)物成分的共性。

圖1 楝揮發(fā)性氣體GC/MS總離子流圖

表1 楝揮發(fā)性氣體成分

2.2 星天牛對楝揮發(fā)性氣體的GC-EAD應用

根據(jù)5次重復實驗的圖譜，選擇出其中一個刺激較為明顯并且具有重復反應的圖譜，星天牛成蟲對20種揮發(fā)性物質的GC-EAD分析結果，如圖2所示。

圖2 星天牛對楝樹枝揮發(fā)性化學物質的GC-EAD反應圖譜

由圖2可知星天牛成蟲的觸角對5種化合物的刺激作用比較敏感，其中β-蒎烯刺激活性最高，左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇能對光肩星天牛成蟲的觸角喚起輕度的反應，其余化合物對觸角沒有明顯的刺激反應。

3 結論

利用動態(tài)頂空套袋法對楝自然狀態(tài)下?lián)]發(fā)的氣體進行收集，并通過氣相色譜與質譜聯(lián)用儀進行進一步的分析與鑒定，能比較真實的反映出自然狀態(tài)下楝所釋放出的氣體情況。本次實驗表明，星天牛嗜食樹種楝的揮發(fā)性物質主要由20種化合物組成，自然狀態(tài)下的揮發(fā)性氣體強度以萜烯類最多，達到89.07%，醇類和酮類化合物相對較弱。萜類化合物分布廣泛，種類繁多，是植物次生代謝物中最多的一類化合物[12～14]。

昆蟲的化學信息物質具有明顯的物種特異性，并且在昆蟲的生境選擇、交配定位和種群分布過程中起著重要作用。研究化學信息物質對昆蟲觸角的GC-EAD反應有利于篩選生物活性化合物，為害蟲的綜合治理提供有效的生態(tài)防治方法。

以往在研究植物揮發(fā)物和昆蟲之間的關系時，首先根據(jù)文獻通過篩選初步確定目標組分；然后利用試劑純品逐一進行生物測定以確定其對昆蟲的行為反應（EAG測定技術），過程重復，操作繁瑣，相比之下，利用GC-EAD技術可以直接用揮發(fā)物的提取物檢測得到活性組分。本次實驗GC-EAD的測定結果表明楝的揮發(fā)性化學物質中有5種化合物對星天牛成蟲觸角的刺激作用比較明顯，其中β-蒎烯刺激活性最高，其次為左旋-α-蒎烯、月桂烯、丁苯、桃金娘烯醇，其數(shù)據(jù)與以前相比，更為可靠、有效，同時很大程度上可以提高工作效率。這 5種化合物對星天牛野外的實際誘集能力如何，最終要通過具體的野外生物測定進一步確定，而后研制出對星天牛具有一定引誘作用的引誘劑配方，為星天牛的防治提供新的技術手段。

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GC-EAD Response of Anoplophora chinensis to Volatiles from Melia azedarach

LIU Jia-min，XU Hua-chao*
（Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China）

Voltile organic compounds/VOCs from Melia azedarach were collected by dynamic headspace and determined by TDS/ GC/MS. Response of Anoplophora chinensis to VOCs was detected by GC-EAD. The result demonstrated that there were 20 types of VOCs from M. azedarach, including 8 terpenoids(97.71%), 5 aromatics(1.021%), 3 alcohols(0.23%), 1 ketones(0.02%). GC-EAD detection showed that that the antenna of A. chinensis were sensitive to five compounds. Beta-pinene had the most effective to the insect, and L-alpha-pinene, myrcene, styrene butadiene and myrtenol had litter effect.

Anoplophora chinensis; head space collection; GC-MS；GC-EAD

S763.38

A

1001-3776（2014）02-0028-04

2013-09-12；

2014-02-12

浙江省科技廳重大科技專項重點項目（2010C12029）

劉佳敏（1987－），女，山西人，碩士生；*通訊作者。