高月庭，周?chē)?guó)英*，何小勇，王明月

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院研究生工作站，浙江 麗水 323000；3. 浙江省麗水市林業(yè)有害生物防治檢疫總站，浙江 麗水 323000）

拮抗細(xì)菌Y13對(duì)油茶炭疽病防治試驗(yàn)

高月庭1，周?chē)?guó)英1*，何小勇2，王明月3

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2. 浙江省麗水市林業(yè)科學(xué)研究院研究生工作站，浙江 麗水 323000；3. 浙江省麗水市林業(yè)有害生物防治檢疫總站，浙江 麗水 323000）

通過(guò)設(shè)計(jì)2個(gè)單因素試驗(yàn)，以施用濃度和施用時(shí)間為因素，分別選取3個(gè)水平，以防治效果、嚴(yán)重度和Y13對(duì)生長(zhǎng)影響作為指標(biāo)，進(jìn)行單因素方差分析的多重比較。結(jié)果表明，兩組單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)油茶成林炭疽病均起到了良好的防治效果；當(dāng)Y13濃度達(dá)到1010cfu/mL時(shí)，防治效果最高，炭疽病的嚴(yán)重度最低，葉片生長(zhǎng)量最高；4月和6月同時(shí)施用使生防效果達(dá)到最優(yōu)，可見(jiàn)高濃度和多次數(shù)施用是防治成林炭疽病重要的影響因子。

油茶炭疽??；內(nèi)生拮抗細(xì)菌；生物防效；影響因子

油茶（Camellia oleifera）是我國(guó)南方特有的食用油料樹(shù)種，亦是世界四大木本油料樹(shù)種之一[1]，已有2 000多年的栽培歷史。它抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，以湖南、浙江、江西、廣西為主，適種于廣大的紅壤丘陵低地區(qū)。油茶炭疽?。ˋnthracnose）是油茶常見(jiàn)病害之一，在我國(guó)油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，引起嚴(yán)重落果、落蕾、落葉、枝枯，甚至整株衰亡[2]。據(jù)調(diào)查，浙江省油茶炭疽病嚴(yán)重病區(qū)發(fā)病率高達(dá) 80%，病樹(shù)的平均存果率比無(wú)病樹(shù)降低了63.3%，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，提高油茶炭疽病的防治技術(shù)，特別是探索生物防治技術(shù)，是油茶生產(chǎn)的當(dāng)務(wù)之急。

Y13是由中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從健康油茶葉片中分離篩選的拮抗細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，對(duì)油茶炭疽病的平板抑菌率達(dá)到84.1%[4]，盆栽試驗(yàn)防治效果也達(dá)到了77.23%[5]，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)影響該菌株的生物防效的二種重要因素進(jìn)行林間試驗(yàn)，探究在自然微生態(tài)環(huán)境下Y13對(duì)油茶炭疽病的影響。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其培養(yǎng)

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Y13，由中南林業(yè)科技大學(xué)教育部經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉膏1.2 g，蛋白胨4.0 g，NaCl 2 g，瓊脂20 g，水1 000 mL；Y13最大抑菌活性培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，酵母膏10g，牛肉膏 28g，NaCl 1.2%，水1 000 mL；Y13最大生長(zhǎng)量培養(yǎng)基：葡萄糖25 g，酵母膏10 g，牛肉膏3 g，NaCl 1.5%，水1 000 mL。

1.1.3 拮抗菌Y13施用原液的配置 Y13用NA培養(yǎng)基將菌種活化后，采用Y13最大抑菌活性培養(yǎng)基做一級(jí)種子發(fā)酵液，再用Y13最大生長(zhǎng)量培養(yǎng)基做二級(jí)種子發(fā)酵液，之后繼續(xù)擴(kuò)繁。平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)抑菌率達(dá)到88%。亞甲基藍(lán)（國(guó)產(chǎn)生物染色劑）染色后，用血小板計(jì)數(shù)法測(cè)量原液中孢子數(shù)量，目測(cè)顯微鏡視野中80 ~ 100個(gè)孢子，基本達(dá)到1010cfu/mL，其它濃度按相應(yīng)比例用無(wú)菌水稀釋10倍，100倍備用。

1.1.4 Y13噴施菌劑抑菌率測(cè)定 將配好的噴施液于備用的炭疽病病原菌做平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌圈的大小，得出抑菌率達(dá)到84%。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1 濃度試驗(yàn)處理 研究在浙江省松陽(yáng)縣象溪鎮(zhèn)下了兒村（28°45′ N，119°48′ E）設(shè)置不同濃度Y13防控試驗(yàn)。該地海拔430 m，位于南坡，坡度30°，油茶林齡30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病發(fā)生。試驗(yàn)隨機(jī)設(shè)3個(gè)處理1個(gè)對(duì)照，每處理面積20 m×20 m，中間設(shè)置隔離帶2 m。每個(gè)處理噴施不同濃度的Y13原液，分別為A1（噴施108cfu/mL)，A2（噴施109cfu/mL），A3（噴施1010cfu/mL），ck（清水對(duì)照）。每個(gè)處理重復(fù)3次。根據(jù)處理濃度，將配置好的Y13原液用農(nóng)用型噴霧器噴灑整株油茶至葉片滴水。4月和6月各噴施一次，每次噴施后，間隔25 d再?lài)娨淮芜M(jìn)行藥效加強(qiáng)。其他撫育措施均按常規(guī)處理。

1.2.2 時(shí)間試驗(yàn)處理 研究在浙江省遂昌縣三仁鄉(xiāng)排前村（28°43′ N，119°63′ E）設(shè)置不同時(shí)間Y13防控試驗(yàn)，該地海拔396 m，位于南坡，坡度33°，油茶林齡30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病發(fā)生。試驗(yàn)隨機(jī)設(shè)3個(gè)處理1個(gè)對(duì)照，每處理面積20 m×20 m，中間設(shè)置隔離帶2 m，四角定樁用紅繩圈定。每個(gè)處理在不同時(shí)間噴施1010cfu/mL濃度的Y13原液。分別為分別B1（4月下旬噴施），B2（6月下旬噴施），B3（4月下旬和6月下旬各噴施1次），ck（清水對(duì)照）。每個(gè)處理重復(fù)3次。根據(jù)處理時(shí)間，將配置好的1010cfu/mL的Y13原液用農(nóng)用型噴霧器噴灑整株油茶至葉片滴水。每次噴施后，間隔25 d再?lài)?次進(jìn)行藥效加強(qiáng)。其他撫育措施均按常規(guī)處理。

1.3 生物防效調(diào)查

1.3.1 采樣調(diào)查 于10月中旬每個(gè)樣方對(duì)角線(xiàn)隨機(jī)選取3株油茶樹(shù)，每株樹(shù)東南西北隨機(jī)抽取15 ~ 20 cm的新抽枝條，收集所有油茶葉片。

1.3.2 防治效果測(cè)定方法 采集葉片后，用MRS-9600TFU2L Scan Maker進(jìn)行掃描，對(duì)已收集的數(shù)據(jù)選用DTOPSIS法綜合評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)油茶的病情指數(shù)[3]。根據(jù)林業(yè)行業(yè)對(duì)于植株防治效果的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算防治效果，防效 =（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.3.3 病害嚴(yán)重度的測(cè)量 對(duì)已收集的數(shù)據(jù)采用 LA-S系列植物圖像分析儀系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)葉片總面積和葉片病斑面積。病害嚴(yán)重度為（發(fā)病葉片病斑總面積/發(fā)病葉片總面積）×100%

1.3.4 新葉生長(zhǎng)量的測(cè)量 經(jīng)分析儀系統(tǒng)將采集到的新葉片面積計(jì)算加和。

1.4 數(shù)據(jù)處理

大數(shù)據(jù)將人與物、物與物關(guān)聯(lián)，新技術(shù)則給內(nèi)容提供更優(yōu)勢(shì)的供給，運(yùn)用AR（Augmented Reality ）增強(qiáng)現(xiàn)實(shí)技術(shù)可以將傳統(tǒng)的方言傳播轉(zhuǎn)化為參與式傳播與沉浸式傳播，用戶(hù)以方言文化作為共同屬性出發(fā)，建立共有社交情景，在人與信息之間進(jìn)行價(jià)值轉(zhuǎn)換，直至形成關(guān)系閉環(huán)。因此，結(jié)合大數(shù)據(jù)和以AR為代表的前沿技術(shù)可分析得出方言傳播機(jī)制漸進(jìn)層次（見(jiàn)圖1），為方言傳播拓展新維度、提出新范式提供有效依據(jù)。

以防治效果、病害嚴(yán)重度以及植株新葉生長(zhǎng)量作為指標(biāo)，采用Microsoft Excel 2003整理，用SPSS19.0軟件進(jìn)行一般線(xiàn)性模型單因素處理，方差分析采用單因素新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Y13對(duì)油茶成林炭疽病的防控效果

由表1可知，在防治效果這一檢驗(yàn)指標(biāo)中，3個(gè)濃度在P = 0.01水平呈極顯著差異。3種噴施濃度都對(duì)油茶成林炭疽病起到了明顯的抑制作用，且防治效果隨濃度的升高而逐漸增加。當(dāng)濃度為1010cfu/mL時(shí)，防治效果達(dá)到最高，均值為56.21%。

表1 不同濃度Y13對(duì)油茶成林炭疽病的防控效果比較

以病害嚴(yán)重度作為指標(biāo)，3個(gè)濃度在P = 0.01水平中A3與A1、A2呈極顯著差異，A1與A2無(wú)差異。不同施用濃度的處理均對(duì)油茶成林炭疽病起到了一定的抑制作用。濃度越高，病害的嚴(yán)重度越低。當(dāng)濃度為1010cfu/mL時(shí)，嚴(yán)重度達(dá)到最低，均值為34%。而A1、A2與ck并不存在差異，說(shuō)明108、109cfu/mL這2種濃度并未對(duì)炭疽病的嚴(yán)重度起到太大的效果，可能是由于濃度較低的Y13不利于微生物的定殖，因此沒(méi)有發(fā)揮其拮抗的抑制作用。

以新葉生長(zhǎng)量為檢驗(yàn)指標(biāo)，3個(gè)濃度在P = 0.01水平A1、A2與A3呈極顯著差異，A1、A2、CK無(wú)差異?？傮w來(lái)看濃度越高，新葉總面積越大。當(dāng)濃度為1010cfu/mL時(shí)，新葉總面積達(dá)到最高。由此說(shuō)明高濃度的枯草芽孢桿菌對(duì)植物的生長(zhǎng)有一定的影響能力。

綜上所述，3個(gè)指標(biāo)結(jié)果一致，1010cfu/mL這一濃度對(duì)Y13防治油茶成林炭疽病起到了較好的防治效果。

2.2 不同的施用時(shí)間Y13對(duì)油茶成林炭疽病的影響

表2 不同的施用時(shí)間Y13防治油茶炭疽病效果比較

以病害嚴(yán)重度作為指標(biāo)顯示，在不同時(shí)間施用1010cfu/mL的Y13對(duì)炭疽病嚴(yán)重度的影響在P = 0.05水平存在顯著差異，3個(gè)時(shí)間水平中B3與B2、B1達(dá)到顯著差異，B1與B2、ck間無(wú)差異。說(shuō)明兩月共同施用的效果明顯好于單月噴施，能夠使炭疽病的嚴(yán)重度降低。而4月施用與對(duì)照相比，嚴(yán)重度降低的最少。在P = 0.01水平下，3個(gè)時(shí)間無(wú)差異。

新葉生長(zhǎng)量這一檢驗(yàn)指標(biāo)中顯示，在P = 0.05水平B1、B2、CK與B3存在顯著差異（Sig = 0.046＜0.05），而P = 0.01無(wú)顯著差異。說(shuō)明單月施用Y13對(duì)油茶生長(zhǎng)狀況的影響并不是很大。這可能是由于雙月施用能夠使枯草芽孢桿菌的定殖能力增強(qiáng)，從而有效的在油茶葉片上繁殖。

綜上所述，3個(gè)檢驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果一致，5月和7月是油茶炭疽病爆發(fā)的高峰期，在兩次爆發(fā)前都使用生防菌，總體效果要優(yōu)于單次使用。

3 討論

枯草芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力[6]。Y13是油茶內(nèi)生拮抗細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)室盆栽防治油茶炭疽病有很好的效果，也具有一定的廣譜性[5]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)單因素的林間成林實(shí)驗(yàn)，目的是要探求該拮抗菌在自然微生態(tài)環(huán)境下，對(duì)于發(fā)病嚴(yán)重老林的生物防治效果。

生物均具有一定的生態(tài)適應(yīng)性。在一定生態(tài)系中引入生防菌，它能否適應(yīng)其被引入的生態(tài)環(huán)境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及與相應(yīng)病原物競(jìng)爭(zhēng)決定著生物防治的成敗，這些都與生防菌的定殖和生物學(xué)特性緊密相關(guān)[7]。由于油茶苗木的葉片和油茶成林葉片的微生態(tài)環(huán)境不同，可能會(huì)造成Y13定殖、抑菌過(guò)程的不同，因此反應(yīng)出的效果也不同。

施用濃度和施用時(shí)間是病害生物防治的兩個(gè)關(guān)鍵因素，由上述結(jié)果反應(yīng)，兩個(gè)因素對(duì)Y13防治油茶炭疽病的生物效果各自表現(xiàn)出不同的差異。當(dāng)Y13濃度達(dá)到 1010cfu/mL時(shí)，防治效果最高，炭疽病的嚴(yán)重度最低，葉片生長(zhǎng)量最高。4月和6月組合施用也使生防效果達(dá)到最優(yōu)。時(shí)間因素并未在葉片生長(zhǎng)量這一指標(biāo)表現(xiàn)差異，可能是與枯草芽孢桿菌的定殖能力有關(guān)。生防枯草芽孢桿菌能促進(jìn)植物根系及植株生長(zhǎng)，增強(qiáng)了植物的抗病性,從而間接地減少病害發(fā)生[8]。由于本試驗(yàn)選擇的樣地是油茶老林，其微生物種群相對(duì)很豐富，有可能阻礙Y13的定殖能力，因此并未在葉片生長(zhǎng)表現(xiàn)作用。

據(jù)報(bào)道，在國(guó)外Selim Dedej為了達(dá)到良好的防治效果，還經(jīng)常利用授粉昆蟲(chóng)傳播生物農(nóng)藥，經(jīng)過(guò)3 a田間試驗(yàn)，利用蜜蜂傳播Serenade粉劑防治美國(guó)越橘病害和進(jìn)行授粉達(dá)到兩重功效，取得了不錯(cuò)的生物防治效果[9]。因此繼續(xù)探索生防因子是否適應(yīng)并在自然微生態(tài)環(huán)境下發(fā)揮其拮抗與抑制病害的作用仍然需要我們研究。

本人認(rèn)為該次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛎撾x實(shí)驗(yàn)室，可以在復(fù)雜的自然環(huán)境下測(cè)試Y13防治油茶成林炭疽病的生物防控能力，能夠?yàn)閅13生物菌劑繼續(xù)走向產(chǎn)業(yè)化提供一些證實(shí)和依據(jù)。

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Experiment on Prevention and Control of Anthracnose in Adult Camellia oleifera Stand by Y13

GAO Yue-ting1，ZHOU Guo-ying1*，HE Xiao-yong2，WANG Ming-yue3
（1. Key Laboratory of the Ministry of Education for Economic Forestry Cultivation and Protection, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, China; 2. The Graduate Workstation of Lishui Acadmy of Forestry, Lishui 323000, China; 3. Lishui Forest Pest Control and Quarantine Station , Lishui, 323000, China）

Experiment of stands in Songyang and Suichang of Zhejiang tow single factor on prevention and control of Antagonistic endophytic Bacteria Y13 to anthracnose were conducted at adult Camellia oleifera. The results showed that this two single factors played a good role on bio-control of anthracnose. When the concentration up to 1010cfu/mL, Y13 showed the best control effect. And spraying in April and June showed the same bio-control effect. The experiment resulted that high concentration and were the impact bio-control factors.

anthracnose; endophytic antagonist bacteria; biological control; impact factors

S763.1

A

1001-3776（2014）02-0014-04

2013-09-09；

2014-02-18

高月庭（1986－），女，河北張家口人，碩士生，從事森林保護(hù)應(yīng)用微生物研究；*通訊作者。