程俊文，侯寒黎，鄒景泉，賀 亮*，李肖娟

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 蕭山出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 311208；3. 杭州雪域生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311200；）

桑黃胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化研究

程俊文1，侯寒黎2，鄒景泉1，賀 亮1*，李肖娟3

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院 浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；

2. 蕭山出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州 311208；3. 杭州雪域生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311200；）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken組合設(shè)計和響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化桑黃（Phellinus igniarius）液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵工藝條件，結(jié)果表明：桑黃胞外多糖的最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為葡萄糖15.82 g/L，玉米粉10.51 g/L，豆餅粉9.55 g/L；此條件下的驗證試驗表明，此時胞外多糖的得率為461.72 mg/L，與理論值基本吻合。

桑黃；發(fā)酵；胞外多糖；Box-Behnken；響應(yīng)面；

桑黃（Phellinus igniarius）俗稱桑黃菇、桑臣、桑耳等，是一種珍貴的大型藥用真菌。目前，桑黃是國際公認的生物抗癌領(lǐng)域中效果最好的真菌[1]。桑黃具有抗癌、抗炎、抗氧化、提高免疫力、保肝護肝等多種藥用功效[2~3]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三萜、多糖和黃酮類物質(zhì)是其關(guān)鍵藥性成分[4]。目前，桑黃在國際市場上供不應(yīng)求，野生桑黃資源有限，桑黃的人工栽培研究在國內(nèi)又剛剛起步，因此，采用液體發(fā)酵技術(shù)進行桑黃的規(guī)模化生產(chǎn)具有廣闊的前景。

響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數(shù)學(xué)模型。近年來日益受到重視，采用該方法可以建立連續(xù)變量曲面模型，對影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，從而快速有效地確定生物過程的最佳條件，目前已廣泛用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化和酶解等生化反應(yīng)優(yōu)化和模型建立中[5~6]。本實驗以桑黃胞外多糖為目標產(chǎn)物，利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成來提高桑黃液體發(fā)酵胞外多糖的產(chǎn)量，為以后的發(fā)酵和放大實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

桑黃由浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面PDA 用于活化菌種。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯100 g/L，葡萄糖15 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng) 從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面的中部，在26℃培養(yǎng)7 d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng) 將活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶裝培養(yǎng)基150 mL于28℃，150 r/min培養(yǎng)6 d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 采用二級搖瓶，500 mL三角瓶裝液量150 mL，液體菌種接種量為10%，于25℃、150 r/min培養(yǎng)。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 單因素實驗 以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、小麥粉取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，分別進行碳源種類試驗；以酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、麥麩、牛肉浸膏取代酵母粉，分別進行氮源種類試驗；以10 ~ 30 g/L葡萄糖進行碳源濃度梯度試驗，以2 ~ 16 g/L的酵母粉進行氮源濃度梯度試驗。

1.4.2 響應(yīng)面法分析實驗 綜合單因素試驗結(jié)果，選擇葡萄糖、玉米粉、豆餅粉3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理[5]，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，利用Design Expert 8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以－1、0、1進行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis g·L－1

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲干重測定 取100 mL發(fā)酵液，在3 000 r/min離心20 min，自來水洗滌多次后，將菌絲體在105℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）的測定 收集發(fā)酵液，3 000 r/min離心20 min，取上清液，濃縮，加入3倍體積的95%酒精，4℃冰箱醇沉24 h，4 000 r/min離心20 min得沉淀物，用硫酸—苯酚法測定其多糖的含量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

表2 不同碳源和氮源對桑黃液體發(fā)酵胞外多糖的影響Table 2 Effect of carbon and nitrogen resource on EPS

由表2、表3可知：葡萄糖、玉米粉和蔗糖都是較好的碳源，其含量對桑黃胞外多糖的積累隨著濃度的增加而增大，繼續(xù)增大則趨于平穩(wěn)；從生產(chǎn)實際考慮，選擇葡萄糖和玉米粉作為桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)合碳源。酵母粉和豆餅粉都是較好的氮源，其含量對多糖的積累隨著濃度的增大而增大，繼續(xù)增到一定值反而降低；從生產(chǎn)實際考慮，豆餅粉價格低廉，容易獲得，因此選擇豆餅粉作為桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

表3 起始碳源濃度和氮濃度對菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of initial glucose concentration on EPS

2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以胞外多糖得率為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 4 Design and results of RSM

2.2.2 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05軟件對表6實驗數(shù)據(jù)進行分析[7]，獲得桑黃胞外多糖得率對葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的多元二次回歸方程：

由表7可知，以胞外多糖含量為目標函數(shù)的回歸方程回歸效果達到極顯著水平，P值均＜0.000 1；模型的決定系數(shù)R2= 0.990 2，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2= 0.977 5，說明該模型能解釋97.75%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表7中模型失擬項的P值為0.092 7，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表 7的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項、二次項以及X1X2、X1X3、X2X3的交互項對胞外多糖的合成均顯著（p＜0.05）影響；綜合以上表明這個模型建立的回歸方程能運用于桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。

表5 回歸模型方差分析Table 5 ANOVA on regression model

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析 分別將模型中的葡萄糖、玉米粉及豆餅粉的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1、圖2、圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響桑黃發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最顯著的因素為葡萄糖（X1），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。玉米粉（X2）和豆餅粉（X3）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1至圖3可以看出，X1與X3、X2與X3、X1與X2交互作用顯著。

圖1 葡萄糖和玉米粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖Figure 1 Response surface and contour for EPS as a function of glucose and corn meal

圖2 葡萄糖和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖Figure 2 Response surface and contour for EPS as a function of glucose and soybean cake powder

圖3 玉米粉和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖Figure 3 Response surface and contour for EPS as a function of corn meal and soybean cake powder

2.2.4 驗證實驗 通過SAS軟件對上述方程進行求解，得到最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖15.82 g/L，玉米粉10.51 g/L，豆餅粉9.55 g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達476.99 mg/L。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際實驗值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對桑黃在預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件下胞外多糖產(chǎn)量進行實驗驗證。實驗中葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的優(yōu)化值分別為15.82、10.51、9.55 g/L，3組平行實驗，測得胞外多糖產(chǎn)量分別為469.36、462.64、453.18 mg/L，實際胞外多糖平均值為461.72 mg/L，達到了回歸模型預(yù)測理論值的 96.8%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測桑黃胞外多糖產(chǎn)量。

3 結(jié)論

考察了不同碳、氮源營養(yǎng)因子的影響，結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)實踐，選擇葡萄糖和玉米粉為碳源，豆餅粉為氮源，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了桑黃產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)基條件為：葡萄糖15.82 g/L、玉米粉10.51 g/L、豆餅粉9.55 g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達476.99 mg/L。驗證實驗中胞外多糖可得461.72 mg/L，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。

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[6] 王光亞. 保健食品功效成分檢測方法[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

[7] 費榮昌. 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理（第四版）[M]. 無錫：江南大學(xué)出版社，2001.

Experiment on Fermentation Technology for Production of Extracellular Polysaccharides from Phellinus igniarius

CHENG Jun-wen1，HOU Han-li2，ZOU Jing-quan1，HE Liang1*，LI Xiao-juan3
（1. Zhejian g Fo restry Academy, Key Laborato ry o f Biological an d Chemical Utilization of Forest Resources, Hangz hou 3100 23, Chi na; 2. Xiaoshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of Zhejiang, Hangzhou 311208, China; 3. Hangzhou Xueyu Biology Technology Corporation, Hangzhou 311200, China）

Analysis of three-level Box-Behnken factorial design with response surface methodology (RSM) was conducted on fermentation technology for extracellular polysaccharides (EPS) production from Phellinus igniarius based on single factor experiment. The result showed that the optimal fermentation conditions were as follows: glucose 15.82 g/L, corn meal 10.51 g/L and soybean cake powder 9.55 g/L. Verification test demonstrated that the average yield of EPS was 461.72 mg/L, similar to theoretical value of 476.99 mg/L.

Phellinus igniarius; fermentation; extracellular polysaccharide; Box-Behnken; response surface methodology (RSM)

S759.81

A

1001-3776（2014）05-0016-05

2014-05-20；

2014-08-11

浙江省科技廳院所專項（2012F30037）；浙江省科技廳院所專項（2014F50018）；杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關(guān)專項（20120232B48）

程俊文（1981－），男，安徽蕪湖人，碩士，助理研究員，主要從事林源中藥活性成分開發(fā)研究；*通訊作者。