郭 濤

（豐益上海生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海200137）

枸杞是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物，是名貴的藥材和滋補(bǔ)品，能夠養(yǎng)肝明目安神，令人長(zhǎng)壽。枸杞的產(chǎn)區(qū)主要集中在西北地區(qū)，寧夏的枸杞最為著名。有研究發(fā)現(xiàn)，枸杞中含有豐富的類胡蘿卜素。

類胡蘿卜素是一類碳?xì)浠衔铩}卜素及它們的氧化衍生物——葉黃素類的總稱，這類有機(jī)化合物的特點(diǎn)是分子中含有多個(gè)不飽和共軛及非共軛雙鍵，其分子量大小、雙鍵數(shù)目及類型、含氧原子的數(shù)量、官能團(tuán)類型和分子構(gòu)型等特征的不同決定了它們理化特性的差異。類胡蘿卜素具有親脂性，幾乎不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，因此通常采用有機(jī)溶劑提取類胡蘿卜素。對(duì)于高等綠色植物而言，類胡蘿卜素往往與另一種脂溶性色素——葉綠素混雜在一起，因而增加了類胡蘿卜素提取、分離和純化的難度。因此枸杞中類胡蘿卜素的分離研究是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

材料：枸杞，購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

試劑：正己烷、石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇、石英砂、碳酸鈉、BHT、氫氧化鉀、甲醇均為AR級(jí)（國(guó)藥集團(tuán)）；

儀器：高速組織搗碎機(jī)，江蘇江陰科研器械廠；

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-120-02），Shimadzu Co.（Japan）；

紫外 -可見(jiàn)光譜掃描分析儀（UV-265FW），ShimadzuCo.（Japan）；

玻璃層析柱（3.5cm×20cm），定制；

層析缸（100mm×200mm，200mm×200mm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 枸杞色素提取物的制備

有一次，孩子很委屈地找朝敏說(shuō)：“媽媽，同學(xué)們?yōu)槭裁炊疾焕砦遥堪职植皇钦f(shuō)只要樹(shù)立威風(fēng)就不愁沒(méi)有朋友了嗎？難道爸爸都是騙人的？”

準(zhǔn)確稱取200g枸杞，洗凈并瀝干后混入石英砂、碳酸鈉和BHT，在控溫多用高速組織搗碎機(jī)中用900mL萃取劑分3次攪拌萃?。ㄊ覝兀?，每次提取時(shí)間40min。將提取液抽濾合并轉(zhuǎn)入1500mL分液漏斗中，加入100mL的蒸餾水搖勻，避光靜置分層，棄去水相，反復(fù)水洗3次去雜，在有機(jī)相中加適量無(wú)水硫酸鈉，避光靜置除水1h，過(guò)濾，將濾液在40℃以下真空濃縮至干（回收溶劑），即得到枸杞色素提取物，用200mL溶劑溶解即得枸杞色素提取液，充氮密封避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 枸杞色素提取物的皂化（枸杞總類胡蘿卜素的皂化法制備）

取枸杞色素提取液100mL置于250mL棕色試劑瓶中，加入20mL 40%（w/v）氫氧化鉀-甲醇溶液，搖勻后充氮置于暗處，在室溫下皂化12h，將皂化液轉(zhuǎn)入分液漏斗，棄去水相，將石油醚層多次用蒸餾水洗至中性，再用無(wú)水硫酸鈉干燥1h，過(guò)濾，在40℃以下減壓濃縮蒸發(fā)至干，即得枸杞色素非皂化物（總類胡蘿卜素），用100mL石油醚溶解即得枸杞總類胡蘿卜素溶液，置于棕色瓶中，充氮密封，避光低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分析方法

1.3.1 不同溶劑提取液中總類胡蘿卜素含量測(cè)定公式

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式[4]，采用分光光度法測(cè)算不同溶劑提取液中總類胡蘿卜素含量。用前3種溶劑浸提時(shí)直接套用對(duì)應(yīng)的色素含量計(jì)算公式，用石油醚或石油醚-丙酮浸提時(shí)，把浸提液真空濃縮至干后轉(zhuǎn)溶于同體積的丙酮中，利用類胡蘿卜素在丙酮中的經(jīng)驗(yàn)公式測(cè)算相應(yīng)類胡蘿卜素含量。通過(guò)比較每種溶劑浸提液中類胡蘿卜素含量的多少，即可選擇出合適的溶劑。各提取液中總類胡蘿卜素含量測(cè)定公式分別如下：

在甲醇中：

上式中：D為葉綠素a濃度（μg/mL提取液），E為葉綠素b濃度（μg/mL提取液），F(xiàn)為總類胡蘿卜素濃度（μg/mL提取液），G為總類胡蘿卜素含量，λ為不同波長(zhǎng)的光密度。

1.3.2 枸杞類胡蘿卜素提取率的測(cè)定

精確稱取10.0000g枸杞粉按1.2中試驗(yàn)方法極限浸提，攪拌研磨充分提取色素，定容定量，用分光光度法測(cè)定色素濃度，重復(fù)3次，取平均值，用于計(jì)算總類胡蘿卜素含量的提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對(duì)浸提效果的影響

分別選用甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚-丙酮（1:1，v/v）四種溶劑按照1.2.1方法進(jìn)行浸提，浸提結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溶劑對(duì)浸提效果的影響Tab.1 The effects of different solvents on the extraction

由表1可知，從總類胡蘿卜素濃度F來(lái)看，浸提效果丙酮>無(wú)水乙醇>石油醚-丙酮 (1:1，v/v)>甲醇；從總類胡蘿卜素與葉綠素a和b之和的比值（G）來(lái)看，石油醚-丙酮（1:1，v/v）>丙酮>無(wú)水乙醇>甲醇。因此，綜合考慮浸提效果、安全性和成本等因素，選用石油醚-丙酮混合溶劑作為浸提溶劑效果最好。

2.2 枸杞類胡蘿卜素提取條件的優(yōu)化

分別考察浸提時(shí)間、浸提次數(shù)、料液比及體積比對(duì)枸杞類胡蘿卜素提取效果的影響，見(jiàn)圖1。

如圖1（a）所示，浸提時(shí)間為2h時(shí)，提取液的類胡蘿卜素濃度為1.253μg/mL，浸提時(shí)間為2.5h時(shí)，類胡蘿卜素濃度為1.254μg/mL，僅增加0.08個(gè)百分點(diǎn)。因此浸提時(shí)間控制在2h以內(nèi)為好。

如圖1（b）所示，浸提次數(shù)越多，類胡蘿卜素提取越完全。浸提3次時(shí)類胡蘿卜素濃度為0.795μg/mL，與浸提1次相比，濃度增加了32.5%；浸提4次和5次的類胡蘿卜素濃度分別為0.807μg/mL和0.811μg/mL，與浸提3次相比，類胡蘿卜素濃度增加較小，分別增加1.51%和0.49%，故浸提次數(shù)選擇3～4次。

圖1（c）比較了料液比對(duì)浸提效果的影響。當(dāng)料液比在90g/mL以內(nèi)時(shí)，所提取的類胡蘿卜素濃度隨料液比值的增大而明顯增加，當(dāng)料液比為120g/mL時(shí)的類胡蘿卜素濃度為1.164μg/mL，超過(guò)120g/mL以后，類胡蘿卜素濃度僅增加0.09%。因此，料液比應(yīng)不超過(guò)120g/mL。

圖1（d）比較了石油醚-丙酮混合溶劑的不同比例對(duì)浸提效果的影響。圖中的橫坐標(biāo)1、2、3、4、5分別代表石油醚-丙酮體積比 3:1、2:1、1:1、1:2、1:3。可見(jiàn)隨著丙酮在混合溶劑中所占比例的增加，溶劑極性也逐步增強(qiáng)，當(dāng)石油醚與丙酮的體積比小于1:1時(shí)，溶劑極性較強(qiáng)，反之則較弱。隨著溶劑極性的增強(qiáng)，類胡蘿卜素的濃度逐漸增大，當(dāng)石油醚與丙酮的比例為1:3時(shí)，濃度達(dá)到最大。

圖1 浸提條件對(duì)枸杞類胡蘿卜素浸提效果的影響Fig.1 Effecton carotenoidsextraction from Lycium Chinensis byextractingcondition

按照1.3.2方法測(cè)得枸杞總類胡蘿卜素的含量為552.57mg/kg，用2.2最佳浸提條件下其總類胡蘿卜素的提取率可達(dá)95.5%。

2.3 枸杞類胡蘿卜素柱層析分離和純化條件

2.3.1 吸附劑選擇

以枸杞色素提取物和不皂化物（總類胡蘿卜素）為材料，洗脫劑選擇正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附劑嘗試為硅膠、氧化鋁、聚酰胺、碳酸鎂、氧化鎂、碳酸鎂-硅藻土=1:1（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:1（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）、氧化鎂-硅藻土=1:3（w/w），不同吸附劑對(duì)洗脫的影響見(jiàn)表2。

表2 不同吸附劑對(duì)洗脫的影響Tab.2 The effect of different elution adsorbent

表2顯示，將氧化鎂與硅藻土按不同比例混合裝柱的分離效果明顯好于其它，并且隨著硅藻土的增加，洗脫速度依次加快，綜合比較分離速度、分離效果、柱床穩(wěn)定性及可再生性，以氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）的組合為最佳吸附劑。

2.3.2 枸杞類胡蘿卜素薄層層析分離和純化條件

以2.3.1分離得到的類胡蘿卜素及不皂化物為材料，用硅膠G薄層層析對(duì)它做進(jìn)一步的分離和純化。吸附劑選擇為氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w），薄層展開(kāi)劑為石油醚-丙酮=17:4。

圖2可知，枸杞色素主要類型有黃色素、紅色素和綠色素，皂化后剩下黃色素和紅色素，綠色素消失由圖4可知其紫外可見(jiàn)光譜都呈相似的“三指狀”（three-peak spectrum）。在可見(jiàn)光區(qū)有吸收峰表明分子中有共軛雙鍵，光譜區(qū)在350～550nm之間，最高峰和次高峰分別為445.0nm及472.4nm，這是類胡蘿卜素的典型圖譜。因此，展開(kāi)劑選用石油醚-丙酮=17:4（v/v），對(duì)枸杞色素提取液、枸杞總類胡蘿卜素樣品的分離效果很好，并且經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，這種分離純化方法重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠、可滿足精細(xì)分離和樣品制備的需要。

圖2 枸杞類胡蘿卜素的薄層層析分離純化效果溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.2 Separation and purification of separation and purification of chinensiscarotenoids from Lycium chinensis by thin-layer chromatography(TLC)

圖3 枸杞色素提取物的紫外可見(jiàn)光譜溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.3 UV-VIS spectrum of pigment extracts of Lycium chinensis

圖4 枸杞色素非皂化物的紫外可見(jiàn)光譜溶劑:石油醚（60～90℃）Fig.4 UV-VIS spectrum of unsaponifiable matter of pigment extracts of Lycium chinensis

3 結(jié)論

1）對(duì)枸杞類胡蘿卜素的浸提條件進(jìn)行了研究。得到的最佳參數(shù)是：浸提液為石油醚-丙酮（1:3，v/v）混合溶劑，料液比為90（g/mL），在常溫下分3次浸提，總浸提時(shí)間為1.5h。枸杞總類胡蘿卜素的含量為552.57mg/kg，在此條件下其總類胡蘿卜素的提取率可達(dá)95.5%。

2）對(duì)分離效果的研究。洗脫劑選擇正己烷-丙酮=90:10（v/v），吸附劑選擇為氧化鎂-硅藻土=1:2（w/w）；薄層展開(kāi)劑選擇為石油醚-丙酮=17:4，此條件下對(duì)枸杞色素提取液、枸杞總類胡蘿卜素樣品有很好的分離效果。

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