徐兆剛 董周永 周亞軍 徐艷陽(yáng)

（吉林大學(xué)，吉林長(zhǎng)春130012）

自Harman提出自由基理論以來(lái)，機(jī)體氧化產(chǎn)生的自由基與衰老和疾病之間的關(guān)系逐漸引起了學(xué)者們的注意。很多研究表明，癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、老年癡呆癥等疾病都與自由基有關(guān)[1]。Salim等[2]研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體過(guò)氧化能夠?qū)е赂哐獕汉?型糖尿病。雖然抗氧化劑已在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，但大部分都屬于人工合成的，這些抗氧化劑存在很多安全隱患[3]。抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化活性，且無(wú)毒或低毒，目前已成為世界各國(guó)學(xué)者們爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn)，而且部分抗氧化肽已經(jīng)得到初步的應(yīng)用。本文簡(jiǎn)要的介紹了抗氧化肽的來(lái)源，重點(diǎn)闡述了抗氧化肽抗氧化活性的體外評(píng)價(jià)方法，分析了實(shí)現(xiàn)體外評(píng)價(jià)方法統(tǒng)一化的可行性，以期為實(shí)現(xiàn)抗氧化肽評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一，提高各研究之間的可比性提供參考。

1 抗氧化肽的主要來(lái)源

抗氧化肽的來(lái)源可以分為三類：天然抗氧化肽、人工合成抗氧化肽以及蛋白降解產(chǎn)生的抗氧化肽。天然抗氧化肽也叫內(nèi)源性抗氧化肽，主要是指生物體內(nèi)天然存在的一類具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)，這類多肽具有清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。目前能夠明確其分子結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步研究其抗氧化機(jī)理的天然抗氧化肽主要有肌肽和谷胱甘肽等[4]。

人工合成抗氧化肽是指利用化學(xué)合成、酶法合成以及生物工程技術(shù)等途徑制成的抗氧化肽。此類抗氧化肽的合成具有定向性，利用固相、液相合成法或合成酶的催化作用等，以氨基酸、小肽等為原料，定向合成目標(biāo)抗氧化肽。

利用蛋白降解產(chǎn)生抗氧化肽是抗氧化研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，它是利用動(dòng)植物蛋白降解產(chǎn)生抗氧化肽，其方法主要有：酸堿水解法、酶水解法以及發(fā)酵法。目前采用發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)抗氧化肽的研究較少，酸堿水解法也已逐漸被淘汰，而酶解法因其條件比較溫和，副產(chǎn)物少，安全性高且產(chǎn)物活性好等原因應(yīng)用較多，相對(duì)比較成熟。

2 抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法及混合肽各組分間的相互作用關(guān)系

2.1 抗氧化活性的評(píng)價(jià)方法

2.1.1 常用方法

目前，已經(jīng)建立的評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的方法有很多，研究者們可以利用這些方法便捷地評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)本身的以及經(jīng)過(guò)消化吸收后在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力[5]?，F(xiàn)行的體外抗氧化力的評(píng)價(jià)方法主要有：清除自由基的能力、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力、還原力的測(cè)定以及螯合金屬離子的能力。

目前國(guó)內(nèi)外運(yùn)用較多的測(cè)定自由基清除能力的方法是：氧自由基吸收量（ORAC）的測(cè)定、ABTS法、DPPH法、羥自由基法，超氧陰離子自由基法等。ABTS和DPPH體系產(chǎn)生的自由基較穩(wěn)定，但因其自由基在生物體內(nèi)并非自然存在，為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具準(zhǔn)確性，現(xiàn)在越來(lái)越多的使用ORAC法。

檢測(cè)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力的方法主要有：硫代巴比妥酸（TBAS）法、亞油酸自氧化法（又稱硫氰酸鐵法）、電子自旋共振法。其中硫代巴比妥酸法較常用，其主要原理是利用TBAS與脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）作用生成粉紅色物質(zhì)，在532～535nm處有最大吸收，通過(guò)測(cè)定MDA含量，在一定程度上反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度。

還原力的測(cè)定，通常被用來(lái)評(píng)價(jià)天然抗氧化物的提供氫原子或者提供電子的能力，具有較高還原力的物質(zhì)通常具有較好的供電子能力[6]，因此，物質(zhì)的還原力通常被看作是評(píng)價(jià)其抗氧化活力的重要指標(biāo)。目前檢測(cè)還原力的方法主要有對(duì)亞鐵還原力（FRAP）的測(cè)定和對(duì)鉬還原力的測(cè)定。

螯合金屬離子能力的檢測(cè)方法目前主要有螯合鐵離子法和螯合銅離子法等。在正常機(jī)體內(nèi)，亞鐵離子可以催化氧離子轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的氫氧根離子，當(dāng)有螯合劑存在時(shí)，亞鐵離子被螯合，減緩了這一過(guò)程。Kim等[7]研究胃腸消化蛋白產(chǎn)生的抗氧化肽時(shí)指出其抗氧化活性與螯合金屬離子有關(guān)。因此，評(píng)價(jià)抗氧化物的螯合能力可以間接地評(píng)價(jià)其抗氧化性能。此外，還有一些常用方法，如結(jié)晶紫法、亞硝基R鹽鈷離子褪色法、2-脫氧-D-核糖法、鄰苯三酚（焦性沒食子酸）的自氧化法等。

上述體外評(píng)價(jià)方法均屬于化學(xué)方法，而生物體內(nèi)氧化過(guò)程極其復(fù)雜，因而導(dǎo)致在采用上述方法評(píng)價(jià)時(shí)，顯示較好抗氧化效果的肽未必在生物體內(nèi)能取得良好的抗氧化效果。因此，在化學(xué)方法評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上需進(jìn)一步結(jié)合生物試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，常用的方法主要有：抑制肝臟線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)法、抑制雙氧水誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血能力實(shí)驗(yàn)、抑制蛋白質(zhì)羰基生成法、質(zhì)粒DNA氧化損傷實(shí)驗(yàn)等。如嚴(yán)群芳[8]利用動(dòng)物體外試驗(yàn)研究大豆抗氧化肽的抗氧化性，結(jié)果表明大豆抗氧化肽能顯著減少紅細(xì)胞自氧化溶血的發(fā)生，對(duì)小鼠肝組織勻漿自發(fā)性及亞鐵離子或過(guò)氧化氫誘導(dǎo)產(chǎn)生的丙二醛有一定的抑制作用，同時(shí)還能極顯著降低小鼠肝線粒體中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的含量，抑制肝線粒體的腫脹。Nazeer等[9]通過(guò)小鼠動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石首魚水解產(chǎn)物能夠提高細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶的活性。

2.1.2 體外評(píng)價(jià)方法之間的關(guān)系

目前研究者們?cè)谠u(píng)價(jià)某種活性肽的抗氧化力時(shí)，通常使用多種方法在不同的條件下進(jìn)行分析，如Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，酶解水稻胚乳蛋白得到的抗氧化肽可抑制脂質(zhì)的自氧化，同時(shí)還含有明顯的DPPH超氧化物及羥自由基清除能力。雖然目前抗氧化肽活性評(píng)價(jià)方法較多，但這些方法之間存在什么關(guān)系，如何選擇，尚未有定論，這使得各實(shí)驗(yàn)間缺乏可比性，急需統(tǒng)一的抗氧化能力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。趙濤[11]對(duì)用凝膠過(guò)濾色譜分離葵花籽粕蛋白酶解物所得3個(gè)組分的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羥自由基：F2>F3>F1；ABTS 自由基：F2>F3>F1；DPPH 自由基：F2>F3>F1?？梢钥闯鲞@3種測(cè)定方法之間可能存在一定的正相關(guān)性。You等[12]研究表明蛋清蛋白抗氧化肽（水溶性的低分子量小肽）可以與水溶性的ABTS自由基充分反應(yīng)，而較難與溶解于有機(jī)溶劑中的DPPH自由基反應(yīng)。由此可以看出ABTS和DPPH法相關(guān)性可能較低。郭洋[13]在對(duì)高活性蛋清抗氧化肽組分進(jìn)行活力評(píng)價(jià)時(shí)，采用了ABTS法、DPPH法、FRAP法和ORAC法，根據(jù)其測(cè)定結(jié)果，DPPH、FRAP以及ORAC結(jié)果大小順序一致，只是各組分間差異大小有所偏差，而ABTS與其他三種結(jié)果截然相反。劉洪對(duì)[14]對(duì)五種花生抗氧化肽體外抗氧化活性進(jìn)行了比較，其結(jié)果為，對(duì)DPPH自由基清除活性的大小順序?yàn)椋篜P2＞AP＞FP＞PP1＞NP；還原力大小為：PP2＞AP＞ FP＞PP1＞NP；對(duì)鐵離子螯合能力大小為：AP＞FP＞PP1＞PP2＞NP；抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力活性能力大小為：PP2＞PP1＞AP＞FP＞NP?？梢钥闯鯠PPH法和還原力法較接近，呈一定的正相關(guān)性。有學(xué)者[15]將亞油酸模擬氧化法對(duì)ABTS法、DPPH法、亞鐵離子螯合能力以及還原能力的測(cè)定做線性回歸分析，得到亞油酸模擬氧化法對(duì)這四種方法的相關(guān)性值，結(jié)果表明：亞油酸-ABTS為0.3861；亞油酸-DPPH為0.7508；亞油酸-螯合亞鐵離子為0.7583；亞油酸-還原力為0.4938。由此可以看出，亞油酸氧化法與螯合亞鐵離子的相關(guān)性最高，而與ABTS的相關(guān)性最低。顧龍建[16]對(duì)合成三肽的疏水性指數(shù)、化學(xué)抗氧化活性、細(xì)胞抗氧化活性（CAA）之間做相關(guān)性分析，結(jié)果表明疏水性指數(shù)與DPPH自由基清除能力及還原力呈顯著負(fù)相關(guān)，合成三肽的CAA值與DPPH自由基清除活性及還原力呈顯著正相關(guān)，基于相同反應(yīng)機(jī)制的抗氧化活性測(cè)定方法間呈顯著正相關(guān)。張明[17]以4種常見的抗氧化劑為試驗(yàn)樣品，利用不同的抗氧化檢測(cè)方法對(duì)其抗氧化效果進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)評(píng)估結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示各檢測(cè)法之間相關(guān)性較高的可以歸納為三組：結(jié)晶紫法、2-脫氧-D-核糖法、TBA法；肝臟線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)分別與結(jié)晶紫法、TBA法、抑制蛋白質(zhì)羰基化檢測(cè)、雙氧水誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血法有很好相關(guān)性；清除DPPH自由基法、亞硝基R鹽鈷離子褪色法、鄰苯三酚自氧化法也有很好相關(guān)性。這些方法在抗氧化肽的抗氧化能力檢測(cè)中是否仍具有這樣的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，抗氧化肽的抗氧化評(píng)價(jià)方法之間的確存在著相關(guān)性，有些方法之間相關(guān)性比較顯著，可以通過(guò)相關(guān)性的大小對(duì)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行分類，從不同類別的評(píng)價(jià)方法中篩選出具有代表性的方法組成一套通用的評(píng)價(jià)體系。這樣可以對(duì)活性肽的抗氧化能力進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)，各評(píng)價(jià)方法之間的相關(guān)性、分類及其同類別作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步的探究。

2.2 混合肽組分間的影響

一直以來(lái)，抗氧化肽與其他化學(xué)抗氧化劑之間的增效作用被廣泛研究，而蛋白降解產(chǎn)生的抗氧化肽是以一種肽的混合物狀態(tài)出現(xiàn)的，不同抗氧化肽組分之間是否有影響近些年也引起了研究者們的注意。李艷伏[18]的研究結(jié)果表明，核桃粕蛋白酶解物經(jīng)過(guò)分離純化后并沒有因?yàn)榧兌忍岣叨@著的提高抗氧化活性，甚至有的還降低了，而且提純前對(duì)O2-·清除率比對(duì)·OH清除率高，而提純后則相反。這也說(shuō)明了不同肽之間可能存在相互作用，從而影響其抗氧化性。有學(xué)者[15]對(duì)一組混合肽的相互作用對(duì)總抗氧化能力的影響做了研究，結(jié)果表明，自由基清除能力較強(qiáng)的肽與清除能力較弱的肽在特定的情況下有微弱的協(xié)同增效的作用（ABTS清除能力），清除自由基能力較強(qiáng)的肽之間在ABTS自由基清除能力評(píng)價(jià)中幾乎都表現(xiàn)出加和或者拮抗作用，沒有協(xié)同增效作用；而在鐵離子還原能力測(cè)試中，其協(xié)同增效作用，均受主抗氧化劑（其中抗氧化活性較強(qiáng)的物質(zhì)）濃度的影響，一定條件下產(chǎn)生增效作用；在ABTS體系中有相互作用的混合肽在亞油酸體系中卻沒表現(xiàn)出增效作用。Saito等[19]研究化學(xué)合成的三肽，發(fā)現(xiàn)這些三肽之間在亞油酸體系中沒有協(xié)同增效作用。

綜上可知，抗氧化肽之間在還原力測(cè)試方面在一定條件下可以產(chǎn)生增效作用，而在ABTS和亞油酸體系中效果不明顯。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)此相關(guān)的報(bào)道不多，但工業(yè)上使用的抗氧化肽多屬于混合肽類，因此，混合肽之間相互作用的關(guān)系及其作用機(jī)理也有待于進(jìn)一步的研究開發(fā)。

3 抗氧化肽的應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)

目前國(guó)內(nèi)對(duì)抗氧化肽的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，只有少部分抗氧化肽得到實(shí)際應(yīng)用，其研究開發(fā)領(lǐng)域主要集中在食品、醫(yī)藥、飼料以及化妝品等行業(yè)。

抗氧化肽在食品中的應(yīng)用主要是利用其高抗氧化活性以及安全性，尤其是一些抗氧化肽的自由基淬滅能力，對(duì)油脂的抗氧化能力，對(duì)金屬離子的螯合能力不弱于人工抗氧化劑BHA等[20]，從而可以替代傳統(tǒng)的抗氧化劑，并且肽類物質(zhì)，能夠被人體所需被吸收，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更豐富?？寡趸某俗鳛榭寡趸瘎┦褂猛猓€可以作為功能因子等用于功能性食品的開發(fā)。如游麗君[21]通過(guò)研究泥鰍蛋白抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)泥鰍多肽能夠起到抗疲勞的功效，表明可以將其應(yīng)用到運(yùn)動(dòng)型功能飲料中；吳夏花[22]以核桃仁為原料，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究分離出抗氧化活性較好的抗氧化肽并對(duì)其進(jìn)行富集和冷凍干燥制成營(yíng)養(yǎng)性核桃多肽粉?？寡趸脑谑称分械膽?yīng)用才剛剛起步，仍需要大量的試驗(yàn)和廣泛的探索，但前景十分廣闊。

在醫(yī)藥方面，雖然已有研究表明一些抗氧化肽對(duì)某些與機(jī)體氧化相關(guān)的疾病具有一定的預(yù)防和治療作用，但目前大都處于實(shí)驗(yàn)階段，尚未進(jìn)行臨床研究，只有極少數(shù)如谷胱甘肽、肌肽等被臨床應(yīng)用。如國(guó)云華等[23]將還原型谷胱甘肽應(yīng)用于急性病毒性肝炎的治療中，治療效果明顯，能有效地改善患者肝功能，減輕患者在用藥期間不良的反應(yīng)。

目前國(guó)內(nèi)外抗氧化肽發(fā)展都很迅速，但在抗氧化肽的制備上存在一些問題，如對(duì)適宜蛋白酶的選擇，控制酶解等關(guān)鍵技術(shù)以及活性肽脫苦等問題尚待解決。通過(guò)研究比較各評(píng)價(jià)方法之間的關(guān)系，篩選出一套通用的方法是可行的，這將增加各研究之間的可比性，便于抗氧化肽功能的研究，對(duì)于實(shí)際研究具有重要的意義。目前抗氧化肽與其他非肽類抗氧化劑增效作用研究較多，但混合肽之間的作用關(guān)系研究較少，抗氧化肽功能的開發(fā)研究，必將成為一個(gè)重要的課題。

[1]Sarmadi B H，Ismail A.Antioxidative peptides from food proteins：Areview[J].Peptides，2010,31:1949-1956.

[2]Salim S，Asghar M，Chugh G，et al.Oxidative stress：A potential recipe for anxiety，hypertension and insulin resistance[J].Brain Research,2010,1359:178-185.

[3]秦天蒼,于新華,葛寧,等.天然抗氧化劑在食用油中應(yīng)用價(jià)值探討[J].糧食流通技術(shù),2009,5:34-36.

[4]王瑞雪,孫洋,錢方.抗氧化肽及其研究進(jìn)展[J].食品科技，2011,36(05):83-86.

[5]Serrano J，Goni I，Saura-Calixto F.Food antioxidant capacity determined by chemical methods may underestimate the physiologicalantioxidantcapacity[J].FoodResearch International,2007,40(1):15-21.

[6] Thana P，Machmudah S，Goto M, et al. Response surfacemethodologyto supercriticalcarbondioxideextractionofastaxanthinfromHaematococcus pluvialis[J]. Bioresource Technology, 2007, 99(06): 3110-3115.

[7] Kim S Y, Je J Y, Kim S K. Purification and characterization ofantioxidant peptide from hoki (Johnius belengerii) frame protein bygastrointestinal digestion[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry,2007, 18: 31-38.

[8]嚴(yán)群芳.大豆抗氧化肽的分離及其生物活性研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[9]Nazeer R A，Sampath Kumar N S，JaiGanesh R.In vitro and in vivo studies on the antioxidant activity of fish peptide isolated from the croaker(Otolithes ruber)muscle protein hydrolysate[J].Peptides,2012,35:261-268.

[10] Zhang J，et al. Isolation and identification of antioxidativepeptide from rice endosperm protein enzymatic hydrolysatebyconsecutivechromatography and MALDI-TOF/TOF MS/MS [J]. FoodChemistry, 2010, 119: 226-234．

[11]趙濤.葵花籽粕中綠原酸和蛋白酶解肽的制備及生物活性研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[12]You SJ，Udenigwe CC，et al.Multifunctional peptides from egg white lysozyme[J].Food Research International,2010,43:848-855.

[13]郭洋.高活性蛋清抗氧化肽組分優(yōu)選及其增效技術(shù)研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué),2012.

[14]劉洪對(duì),于麗娜,高俊安,等.五種花生抗氧化肽體外抗氧化活性比較[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013,27(8)：1162-1167.

[15]胡曉赟.小肽抗氧化性及協(xié)同作用研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué),2012.

[16]顧龍建.基于谷胱甘肽設(shè)計(jì)的抗氧化肽活性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2013.

[17]張明.幾種體外抗氧化檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)研究[D].西安：陜西師范大學(xué),2010.

[18]李艷伏.核桃粕多肽提取分離及功能特性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[19]Saito K，Jin DH，Ogawa T，et al.Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinational chemistry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(12)：3668-3674.

[20]CHEN J，HU XY.Review on the antioxidant properties of protein hydrolysates[J].JournalofChinese Insituteof Food Science and Technology，2011,11(9):111-119.

[21]游麗君.泥鰍蛋白抗氧化肽的分離純化及抗疲勞、抗癌功效研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2010.

[22]吳夏花.營(yíng)養(yǎng)型核桃多肽粉的研制[D].太原:山西大學(xué),2012.

[23]國(guó)云華，于景宏.還原型谷胱甘肽在急性病毒性肝炎中的治療效果和藥理分析[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng),2013,02:623.