徐標，曾昆，肖政

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院西區(qū)急診部，武漢 430035)

阿托伐他汀對急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌IL-6表達的影響*

徐標，曾昆，肖政

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院西區(qū)急診部，武漢 430035)

目的探討阿托伐他汀對急性心肌梗死后慢性心力衰竭的抑制作用及機制。方法45只雄性急性心肌梗死模型大鼠隨機均分為阿托伐他汀高、低劑量組及模型組(n＝15)。另取10只大鼠作為假手術(shù)組。阿托伐他汀高、低劑量組分別給予阿托伐他汀20,10mg·kg-1·d-1,灌胃6周,假手術(shù)組和模型組不予治療。第6周末以超聲心動圖檢測各組大鼠左心室形態(tài)功能變化,測定左室心肌肥厚指數(shù)(LVHI)。假手術(shù)組取位于左心室游離壁心肌組織,心肌梗死各組取位于左心室梗死區(qū)、交界區(qū)心肌組織分別以免疫熒光激光共聚焦顯微鏡及Western blot檢測白細胞介素(IL)-6表達。結(jié)果模型組、阿托伐他汀高、低劑量組大鼠左室舒張期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮內(nèi)徑(LVESD)、舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)、LVHI、心肌IL-6水平較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05或P<0.01);左室射血分數(shù)(LVEF)較假手術(shù)組降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,高、低劑量阿托伐他汀組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV、LVHI、心肌IL-6水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01),LVEF顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與阿托伐他汀低劑量組比較,高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV、LVHI、心肌IL-6水平均顯著降低(P<0.05),LVEF顯著升高(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀可能通過抑制IL-6過度表達而發(fā)揮抑制心室重塑作用,其作用呈劑量依賴性。

阿托伐他?。恍募」Ｋ?急性；心力衰竭,慢性；心室重塑；白細胞介素-6

研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀除具有調(diào)脂作用外,還具有其他心血管保護作用,包括改善內(nèi)皮功能失調(diào)、抑制炎癥反應、抗血栓形成、穩(wěn)定斑塊等作用［1］,其抑制心室重塑的作用成為近期研究熱點。近年來研究表明,炎癥細胞因子在急性心肌梗死后心室重塑中發(fā)揮重要作用［2］。本研究選擇急性心肌梗死(acute myocardial infraction,AMI)后慢性心力衰竭大鼠為研究對象,觀察不同劑量阿托伐他汀對心肌組織中炎癥細胞因子白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表達變化以及心室重塑程度的影響,探討阿托伐他汀對AMI后慢性心力衰竭的抑制作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠(動物許可證號:HBDW NO:2008-1015),體質(zhì)量(250±30)g,購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心,于屏障環(huán)境中進行飼養(yǎng)和實驗。

1.2 藥物與試劑 阿托伐他汀(商品名:立普妥,輝瑞制藥有限公司,批號:1237175)。兔抗大鼠IL-6單克隆抗體(貨號:BA4339-2)、過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(貨號:BA1055)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號:AR0146)均購自武漢博士德生物工程有限公司。電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒購自美國Pierce公司,貨號:32106。

1.3 動物模型建立及實驗分組 按照王薇娜等［3］提供的方法結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制作AMI模型,術(shù)后24 h存活45只大鼠,隨機均分成模型組和阿托伐他汀高、低劑量組,每組15只。阿托伐他汀高、低劑量組術(shù)后第2天起灌胃給藥6周,劑量分別為10, 20 mg·kg-1·d-1［4］。另設(shè)假手術(shù)組10只,僅在左冠狀動脈前降支穿線不結(jié)扎。假手術(shù)組和模型組每日給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。第6周末AMI后心力衰竭模型建立時［5］,模型組、阿托伐他汀高、低劑量組、假手術(shù)組大鼠分別存活10,12,11,10只。第6周末大鼠稱定質(zhì)量后以3%戊巴比妥30 mg·kg-1行腹腔麻醉,超聲心動圖檢查后迅速開胸,測定左室心肌肥厚指數(shù)(left ventricular hypertrophy index,LVHI)。假手術(shù)組取位于左心室游離壁心肌組織,心肌梗死各組取位于左心室梗死區(qū)、交界區(qū)心肌組織(以結(jié)扎線為標志,梗死蒼白區(qū)邊緣至兩側(cè)邊緣3 mm內(nèi))。

1.4 各組大鼠超聲心動圖檢查 腹腔麻醉大鼠后固定、胸部剪毛,鼠臺向左傾斜30°,采用彩色多普勒超聲診斷儀,將探頭放置于胸骨左側(cè),選取標準左室乳頭肌短軸切面和長軸切面在二維影像指導下采用M型超聲測量以下指標:左室舒張期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮內(nèi)徑(left ventricular end-systole dimension,LVESD)、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、舒張末期容積(end-diastolic volume,EDV)、收縮末期容積(endsystole volume,ESV)。取3個心動周期的平均值,檢測采用雙盲法,由本醫(yī)院超聲科專人操作。

1.5 LVHI測定 大鼠麻醉后開胸取出心臟,以冰0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈,濾紙吸干水分。去除大血管、心房、右心室,取左心室稱其質(zhì)量,進行LVHI測定。LVHI＝左室質(zhì)量/體質(zhì)量(mg·g-1)。

1.6 白細胞介素(interleukin,IL)-6表達 采用免疫熒光激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察各組大鼠心肌。取各組大鼠心肌組織制備10μm厚的冰凍切片,組織切片與心肌縱軸平行,經(jīng)固定、洗脫后以1∶100兔抗大鼠IL-6單克隆一抗孵育過夜,再予1∶100異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的山羊抗兔IgG常溫孵育2 h,封片后即在激光共聚焦顯微鏡下觀察,FITC激發(fā)波長為492 nm,發(fā)射波長為520 nm,切片每張取視野4～6個,選擇細胞縱行走向區(qū)域進行觀察。

1.7 Western blot檢測各組心肌組織IL-6表達 取大鼠心肌組織,每份50 mg,勻漿后加入適量組織蛋白裂解液,離心后吸取上清液,按照BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量測定。在電泳儀上用等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15%SDS-PAGE分離后,轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜(poly vinylidene fluoride,PVDF)膜上。以1∶1 000的兔抗大鼠IL-6單克隆一抗4℃靜置孵育過夜,再以1∶10 000過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h,在暗室用ECL試劑盒發(fā)光顯影,同時檢測βactin的表達作為內(nèi)參對照。圖片經(jīng)吸光度圖像掃描儀(HP)掃描,以Quantity One軟件對結(jié)果進行分析,檢測各組大鼠心肌組織IL-6與β-actin表達灰度的比值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠超聲心動圖左室形態(tài)功能測定 模型組,阿托伐他汀高、低劑量組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV較假手術(shù)組均顯著升高(P<0.05或P< 0.01)；LVEF較假手術(shù)組降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比,高、低劑量阿托伐他汀組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV均顯著降低(P<0.05或P<0.01), LVEF顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與低劑量阿托伐他汀組相比,高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV均顯著降低(P<0.05),LVEF顯著升高(P< 0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠LVHI變化 模型組,阿托伐他汀高、低劑量組大鼠較假手術(shù)組LVHI明顯增高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較,阿托伐他汀高、低劑量組大鼠LVHI明顯下降(P<0.05或P<0.01)。阿托伐他汀高劑量組較低劑量組LVHI明顯下降(P<0.05),見表2。

表1 4組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果Tab.1 Results of u ltrasoundcardiogramin four groups of rats ±s

表1 4組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果Tab.1 Results of u ltrasoundcardiogramin four groups of rats ±s

與假手術(shù)組比較,*1P<0.05,*3P<0.01;與模型組比較,*2P<0.01,*4P<0.05;與阿托伐他汀高劑量組比較,*5P<0.05Compared with shamoperation group,*1P<0.05,*3P<0.01;compared withmodel group,*2P<0.01,*4P<0.05;compared with highdose atorvastatin group,*5P<0.05

組別大鼠/只LVEDD LVESD mmLVEF/ % EDV ESV mm3阿托伐他汀高劑量組12 5.22±0.42*1*22.24±0.43*1*280.5±3.55*1*20.48±0.13*1*20.11±0.03*1*2低劑量組11 5.79±0.54*3*4*52.80±0.51*3*4*575.8±5.52*3*4*50.67±0.22*3*4*50.20±0.09*3*4*5模型組10 6.31±0.56*33.31±0.52*370.5±5.07*30.78±0.21*30.29±0.07*3假手術(shù)組10 4.75±0.31 1.88±0.36 87.5±2.85 0.35±0.14 0.04±0.03

表2 4組大鼠心肌LVHI和IL-6測定Tab.2 Determination of LVHI and IL-6 in cardiac muscle in four groups of rats ±s

表2 4組大鼠心肌LVHI和IL-6測定Tab.2 Determination of LVHI and IL-6 in cardiac muscle in four groups of rats ±s

與假手術(shù)組比較,*1P<0.05,*3P<0.01;與模型組比較,*2P<0.01,*4P<0.05;與阿托伐他汀高劑量組比較,*5P<0.05Compared with shamoperation group,*1P<0.05,*3P<0.01; compared with model group,*2P<0.01,*4P<0.05;compared with high-dose atorvastatin group,*5P<0.05

組別例數(shù)LVHI/ ×10-3IL-6阿托伐他汀 高劑量組12 1.234±0.143*1*20.116±0.031*1*2低劑量組11 2.442±0.135*3*4*50.191±0.032*3*4*5模型組10 3.656±0.191*30.314±0.027*3假手術(shù)組10 0.407±0.031 0.041±0.002

2.3 大鼠心肌IL-6表達部位 模型組、阿托伐他汀高、低劑量組IL-6表達主要在交界區(qū)心肌間質(zhì),少量分布于心肌細胞內(nèi)及梗死區(qū)間質(zhì)。假手術(shù)組僅細胞間質(zhì)有微弱IL-6表達。見圖1。

2.4 大鼠心肌IL-6表達變化 模型組,阿托伐他汀高、低劑量組大鼠較假手術(shù)組心肌IL-6條帶表達明顯增強(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比,高、低劑量阿托伐他汀組大鼠心肌IL-6條帶表達明顯減弱(P< 0.01或P<0.05)。阿托伐他汀高劑量組與低劑量組比較,IL-6條帶表達明顯減弱(P<0.05)。見表2,圖2。

3 討論

IL-6是反映心力衰竭的一個敏感指標,為預后的獨立預測因子。慢性心力衰竭患者IL-6水平升高,且IL-6血漿濃度與心功能分級呈正相關(guān)［6］。心室重塑是AMI后慢性心力衰竭的主要病變過程。當IL-6與其受體蛋白結(jié)合后可導致心肌細胞肥厚后,并能通過NO途徑誘導細胞凋亡,因而導致心室重塑［7-8］。IL-6通過p38絲裂原活化蛋白激酶途徑介導肌質(zhì)網(wǎng)功能和心肌收縮力減弱［9］。應用抗IL-6的IgG抗體治療可使AMI后心室重塑明顯減輕［10］。

圖1 4組大鼠心肌組織中IL-6的表達(×200)A.假手術(shù)組;B.阿托伐他汀高劑量組;C.阿托伐他汀低劑量組;D.模型組Fig.1 IL-6 expression in cardiacmuscle in four groups of rats(×200)A.shamoperation group;B.high-dose atorvastatin group;C.low-dose atorvastatin group;D.model group

圖2 Western blot法測定4組大鼠心肌組織IL-6表達A.假手術(shù)組;B.阿托伐他汀高劑量組;C.阿托伐他汀低劑量組;D.模型組Fig.2 IL-6 expression in cardiac muscle in four groups of rats by W estern blotA.shamoperation group;B.high-dose atorvastatin group;C. low-dose atorvastatin group;D.model group

研究表明,阿托伐他汀對壓力負荷導致的心肌肥厚有明顯的保護作用,同時伴有炎性因子水平降低,說明阿托伐他汀的心肌保護作用可能與其抗炎作用有關(guān)［11］。阿托伐他汀可以降低核因子-κB等炎癥反應重要轉(zhuǎn)錄因子的活性,從而發(fā)揮抗炎作用［12-13］。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)扎冠脈前降支6周后各組大鼠左心室肥厚、室腔擴大,心功能下降,提示成功構(gòu)建大鼠慢性心力衰竭模型。模型組,阿托伐他汀高、低劑量組大鼠心肌IL-6表達呈明顯梯度變化,隨著左心室肥厚、室腔擴大及心功能下降程度的不斷加重,IL-6表達水平亦不斷增高,表明阿托伐他汀可抑制心肌梗死后心室重塑,減輕心力衰竭程度,其機制可能與其抑制IL-6過度表達相關(guān)。阿托伐他汀高劑量組較低劑量組大鼠心力衰竭程度明顯減輕,表明阿托伐他汀治療心肌梗死后慢性心力衰竭的作用可呈劑量依賴性。本研究通過免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察到各造模組大鼠IL-6主要表達于梗死交界區(qū)心肌間質(zhì),提示梗死交界區(qū)嚴重的心肌缺血導致的炎癥反應加重、諸如IL-6等炎性細胞因子的過度表達在AMI后心室重塑發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著更為重要作用,其具體機制尚需進一步研究。

綜上所述,阿托伐他汀獨立于調(diào)脂作用外的抗炎作用在抑制AMI后慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,隨著研究的進一步深入,其臨床作用及其機制將更加豐富,必將成功地應用于急性心肌梗死及其并發(fā)癥的治療。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.007

Effect of Atorvastatin on the Expression of Myocardial IL-6 in Rats with Chronic Heart Failure After Acute Myocardial In farction

XU Biao,ZENG Kun,XIAO Zheng
(Department of Emergency Clinic,Puai Hospital,Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Techology,Wuhan 430035,China)

Objective To investigate the effect and mechanismof atorvastatin on the inhibition of chronic heart failure after acutemyocardial infarction.MethodsForty-fivemale rats with acutemyocardial infarction were divided into high dose atorvastatin group,low dose atorvastatin group and acutemyocardial infarction group(n＝15).Another 10 rats served as shamoperation group.High and low dose atorvastatin group received atorvastatin with 20 mg·kg-1·d-1and 10 mg·kg-1·d-1by gavage for 6 weeks after acutemyocardial infarction.The shamoperation group and the control group received no treatment.At the 6th week,the changes of left ventricularmorphology and function of rats in every group were detected with ultrasonic heartbeat graph.Left ventricular hypertrophy index(LVHI)was determined in every group.The left ventricle free wallmyocardiumin the shamoperation group and the infarction and border zonemyocardiumin myocardial infarction groups were preserved to detect myocardial interleukin-6(IL-6)by immunofluorescence confocalmicroscopy and Western blot.ResultsCompared to the the shamoperation group,there were higher value of left ventricular end-diastolic dimension(LVEDD),left ventricular end-systole dimension(LVESD),end-diastolic volume(EDV),end-systole volume(ESV),LVHI,higher expression levels ofmyocardial IL-6,aswell as lower valuers of left ventricular ejection fraction(LVEF)in themodel group,the groupswith high or low dose atorvastatin(P<0.05 orP<0.01).Compared to the model group,there were lower values of LVEDD,LVESD,EDV,ESV, LVHI,lower expression levels of myocardial IL-6,as well as higher values of LVEF in the groups with high or low dose atorvastatin(P<0.05 orP<0.01).Compared to the the low dose atorvastatin group,there were lower value of LVEDD,LVESD, EDV,ESV,LVHI,lower expression level of myocardial IL-6,as well as higher value of LVEF in the high dose atorvastatin group(P<0.05).ConclusionAtorvastatin may supress ventricular remodeling by inhibiting the over-expression of myocardial IL-6 after acutemyocardial infarction.The effect is dose dependent.

Atorvastatin;Myocardial infraction,acute;Heart failure,chronic;Ventricular remodeling;Interleukin-6

R972.6;R965

A

1004-0781(2014)02-0160-04

2013-04-18

2013-07-16

*武漢市衛(wèi)生局科研項目(WX12D06)

徐標(1979-),男,湖北武漢人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:心血管疾病。電話:027-68831420,E-mail：xubiao110@126.com。