劉偉,周建良,陳碧蓮,祝明

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310004)

五子衍宗丸高效液相色譜指紋圖譜研究*

劉偉1,周建良2,陳碧蓮2,祝明2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310004)

目的 建立五子衍宗丸的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法使用Agilent Extend C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱,柱溫30℃,以乙腈-甲醇(10∶1)和0.4%磷酸為流動相,梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1,檢測波長254 nm,并利用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)對主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果根據(jù)LC-MS數(shù)據(jù)、對照品比對或文獻(xiàn)參照對10個共有峰中的9個色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。用建立的對照指紋圖譜測定16批五子衍宗丸,其相似度均＞0.93。結(jié)論該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。該方法為五子衍宗丸的全面質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

五子衍宗丸;指紋圖譜;色譜法,高效液相

指紋圖譜是評價含多組分的復(fù)雜中藥樣品整體質(zhì)量的有效手段,中藥或中成藥的色譜指紋圖譜分析方法是藥物指紋圖譜分析的一個分支[1-4]。近年來,應(yīng)用色譜指紋圖譜分析方法對中藥材及中藥成藥的質(zhì)量評價已日益廣泛[5-7]。五子衍宗丸是由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)和車前子(鹽炒)加工制成的丸劑,具有補(bǔ)腎益精的功效[8]?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版一部收載的五子衍宗丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定枸杞子、五味子甲素的薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)化學(xué)鑒別方法,但無含量測定項。目前文獻(xiàn)報道的五子衍宗丸含量測定主要是針對五味子甲素、五味子乙素[9-10]及金絲桃苷[11]等單一成分的高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法,這些方法遠(yuǎn)不能滿足中藥現(xiàn)代化的質(zhì)量控制要求。因此,為了更有效地控制五子衍宗丸的質(zhì)量,筆者采用HPLC法建立五子衍宗丸的指紋圖譜,以便實現(xiàn)從多藥物、多成分的系統(tǒng)化角度控制其內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu LC-20ADXR高效液相色譜儀(配備在線脫氣機(jī)、二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和PDA檢測器);美國Agilent 6430液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有ESI離子源和美國Agilent 1260快速液相色譜儀(RRLC)(配有在線脫氣機(jī)、二元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和可變波長檢測器);KODO JAC 4020P超聲波清洗器;METTLERTOLEDO AG285電子天平(十萬分之一)。

1.2 試藥 綠原酸(批號:110753-200413)、金絲桃苷(批號:1521-200202)、毛蕊花糖苷(批號:111530-200505)、山奈酚(批號:110861-200405)、五味子醇甲(批號:110857-200406)、五味子甲素(批號:0764-200107)和五味子乙素(批號:110765-200407)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇均為色譜純(Merck),水為雙蒸水,磷酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),甲酸(純度＞98%,Merck)。共收集到7個廠家生產(chǎn)的16批五子衍宗丸,見表1。

表1 五子衍宗丸樣品來源Tab.1 Origin of wuzi yanzong pill sample

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫30℃;流動相:A為乙腈-甲醇(10∶1);B為0.4%磷酸水溶液,梯度洗脫:0～5 min為5%～15%A;～15 min為15%～19%A;～25 min為19%～21%A;～70min為21%～90%A;流速1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量5 μL。

2.2 參照物溶液的制備 分別精密稱取綠原酸12.03 mg,金絲桃苷18.09 mg,毛蕊花糖苷10.56 mg,山奈酚16.34 mg,五味子醇甲17.38 mg,五味子甲素16.83 mg,五味子乙素7.22 mg,用70%甲醇配成濃度分別為240.6,361.8,211.2,326.8,695.2,841.5, 288.8 μg·mL-1的對照品儲備液,并于4℃保存。分別吸取上述對照品儲備液適量,用70%甲醇分別稀釋10,6,15,30,30,30,30倍得到混合對照品工作液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品2 g,研細(xì),精密稱定,置100 mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理60 min,取出,放冷,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 各單味藥材供試品溶液的制備 取各單味藥材粉末各約1 g,按照“2.3”項方法處理后,制取單味藥材的供試品溶液。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實驗 精密吸取同一份供試品溶液(批號:2035337),在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6次,分別對各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.2%,相對峰面積的RSD均＜4.6%,表明方法精密度較好。

2.5.2 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次的五子衍宗丸樣品(批號:2035337)6份,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按上述色譜條件測定,分別對各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.1%,相對峰面積的RSD均＜2.9%,表明本方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液(批號: 2035337),分別在制備后0,2,4,8,12,24和36 h按上述色譜條件進(jìn)樣測定,分別對各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的變化情況進(jìn)行考察。各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.1%,相對峰面積的RSD均＜3.8%,表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的確定

2.6.1 指紋圖譜的建立 取16批五子衍宗丸,按“2.3”項的方法制備各供試品溶液,吸取各供試品溶液5 μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測定并記錄色譜圖,得到16批五子衍宗丸HPLC指紋圖譜,根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對保留時間,確定共有峰,并選取其中10個共有峰作為特征指紋峰,建立的對照指紋圖譜見圖1。

2.6.2 共有指紋峰的標(biāo)定 五子衍宗丸HPLC指紋圖譜中,共有指紋峰10個,以7號峰(山奈酚)為參照峰(S峰),計算各色譜峰保留時間和峰面積與同一圖譜中S峰的保留時間和峰面積比值,得到的相對保留時間和相對峰面積見表2,3。

圖1 五子衍宗丸HPLC圖Fig.1 HPLC fingerprint of wuzi yanzong pill

2.6.3 共有指紋峰的指認(rèn) 使用LC-MS技術(shù)對HPLC指紋圖譜10個共有峰中的9個色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。LC-MS分析條件如下:色譜條件與“2.1”項一致,僅流動相B改為0.1%甲酸;質(zhì)譜電噴霧離子源(ESI),載氣溫度:350℃;載氣流速:10 L·min-1;噴霧電壓(Nebulizer):238 kPa;毛細(xì)管電壓:4 000 V;正離子檢測模式;碰撞電壓(Fragmentor)135 V;一級全掃描質(zhì)量數(shù)范圍100～1 000。共有峰的鑒定結(jié)果見表4。

2.6.4 制劑與藥材的相關(guān)性 取“2.3”項得到的五子衍宗丸HPLC指紋圖譜與“2.5”項得到的各單味藥的HPLC指紋圖譜進(jìn)行比較,對比各吸收峰的紫外吸收光譜和相對保留時間,確定10個共有峰主要來源于菟絲子、覆盆子、車前子、五味子等4味藥材,與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[12-16],結(jié)果見表4。

表2 16批五子衍宗丸指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of sixteen batches of wuzi yanzong pill

表3 16批五子衍宗丸指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak area of common peaks of sixteen batches of wuzi yanzong pill

表4 五子衍宗丸指紋圖譜共有峰指認(rèn)Tab.4 Analysis result of common peaks of wuzi yanzong pills

2.7 16批五子衍宗丸指紋圖譜相似度評價 將16批五子衍宗丸指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”,進(jìn)行色譜峰匹配,匹配結(jié)果見圖2。相似度計算結(jié)果表明:16批樣品與生成的對照譜之間的相似度依次為0.992,0.988, 0.974,0.990,0.969,0.986,0.984,0.976,0.982, 0.949,0.952,0.998,0.930,0.996,0.961,0.965。

3 討論

3.1 檢測波長的確定 用PAD檢測器在波長200～360 nm范圍對五子衍宗丸供試液進(jìn)行紫外掃描檢測,結(jié)果供試品在254 nm檢測波長下檢出峰數(shù)較多、且響應(yīng)較高,包含的信息量大,故選擇254 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 本實驗曾選用甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫,結(jié)果表明采用這兩種流動相,色譜峰達(dá)不到分離要求,選擇乙腈∶甲醇(10∶1)-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時,色譜峰分離度好,出峰明顯增多且峰形有較大改善,所以選擇乙腈∶甲醇(10∶1)-0.4%磷酸溶液作為本實驗的流動相。

圖2 16批五子衍宗丸HPLC指紋圖譜共有模式圖Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of sisteen batches of wuzi yanzong pill

3.3 供試品溶液制備方法的選擇 分別以乙醇、甲醇和70%甲醇為提取溶劑,并采用超聲和加熱回流兩種提取方式。結(jié)果表明,當(dāng)以70%甲醇提取時,色譜圖出峰數(shù)和響應(yīng)較理想,超聲和加熱回流兩種提取方式得到的色譜圖無明顯區(qū)別。為操作簡便,本實驗選擇70%甲醇超聲60 min為最終提取方法。

3.4 耐用性考察 本實驗比較0.3%,0.4%和0.5%磷酸溶液(水相)對樣品測定的影響,結(jié)果在各條件下各成分均能基線分離,表明不同濃度的磷酸溶液(水相)對本方法幾乎無影響。本實驗選取3種不同品牌的色譜柱Angilent Extend C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm),Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),Ecosil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對樣品進(jìn)行測定,結(jié)果均得到滿意的分離度,表明本法對C18柱品牌無特殊要求。本實驗還比較了25,30,35℃的柱溫對樣品測定的影響,結(jié)果在各條件下各成分均能得到較好的分離度,表明不同的柱溫對本方法幾乎無影響。

本研究建立了五子衍宗丸HPLC指紋圖譜分析方法,共有峰中9個成分已經(jīng)明確,可以反映4種藥材的特性與質(zhì)量。該方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好。應(yīng)用該方法研究五子衍宗丸,可以反映成藥內(nèi)在質(zhì)量和制備工藝的整體差異性。通過對7個廠家16批五子衍宗丸的指紋圖譜研究,獲得特征性、專屬性和整體性的綜合信息,為五子衍宗丸的整體質(zhì)量控制提供方法參考。

[1] 孫國祥,張靜嫻.系統(tǒng)指紋定量法鑒別龍膽瀉肝丸質(zhì)量[J].分析化學(xué),2009,37(8):1183-1187.

[2] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用[J].中國中藥雜志,2001,26(10):653-655.

[3] 洪筱坤,王智華.色譜指紋譜在中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用[J].中成藥,2001,23(3):157-159.

[4] 屠鵬飛.高效液相色譜法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討[J].中成藥,2000,22(7):516.

[5] 王嗣岑,朱麗華,賀浪沖.川芎藥材活性部位的高效液相色譜指紋圖譜定性分析方法[J].西安交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2003,24(3):221-223.

[6] 湯樹良,楊濱,黃璐琦,等.山楂高效液相指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2004,10(4):9-13.

[7] 曾志,楊東暉,宋力飛,等.高效液相色譜指紋圖譜應(yīng)用于板藍(lán)根的鑒定[J].分析化學(xué),2002,30(7):849-852.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:532.

[9] 郭怡飚,胡曉煒,倪美文.RP-HPLC法測定五子衍宗丸中五味子甲素、五味子乙素含量[J].中草藥,2002,33(4): 317-318.

[10] 蔣平,文永盛,吳艷輝,等.五子衍宗丸中五味子乙素的含量測定[J].中國藥師,2006,9(1):9-10.

[11] 李敏芳,李慧,王學(xué)美,等.高效液相色譜法測定五子衍宗丸中金絲桃苷的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志, 2008,14(2):1-3.

[12] 肖嵐,楊梓懿,石繼連.HPLC同時測定菟絲子不同炮制品中五種主要活性成分含量[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2012,32(7):50-53.

[13] 王隸書,王友聯(lián),李明洋,等.HPLC測定市售車前子中毛蕊花糖苷的含量[J].中國藥師,2011,14(11):1581-1582.

[14] 林倩,賈凌云,孫啟時.菟絲子的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2009,26(12):968-971.

[15] 肖洪明,祖靈博,李石平,等.掌葉覆盆子化學(xué)成分的研究[J].中國藥物化學(xué)雜志,2011,21(3):220-226.

[16] 夏麗文,彭麗萍,楊東華,等.超高效液相色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜分析五味子化學(xué)成分[J].中醫(yī)藥信息, 2012,29(4):27-30.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.029

HPLC Fingerprint Analysis of Wuzi Yanzong Pills

LIU Wei1,ZHOU Jian-liang2,CHEN Bi-lian2,ZHU Ming2
(1.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China;2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310004,China)

ObjectiveTo establish the high performance liquid chromatography(HPLC)fingerprint ofwuzi yanzongpills.MethodsHPLC was performed on Agilent Extend C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a gradient elution system using acetonitrile:methanol(10∶1)-0.4%phosphoric acid as the mobile phase.The column temperature was set at 30℃and the flow rate was 1.0 mL·min-1.The eluate was detected at the wavelength of 254 nm.Chromatographic peaks were identified by LC-MS method.ResultsNine common peaks inwuzi yanzongpill samples were identified by comparing their LC-MS data with those of reference compounds and related reference reports.The HPLC fingerprint ofwuzi yanzongpills was finally developed based on the analysis of sixteen batches of samples and their similarities were above 0.93.ConclusionThis method has high precision,stability and repeatability.This study could be used for overall quality assessment ofwuzi yanzongpills.

Wuzi yanzongpills;Fingerprint;Chromatography,high performance liquid

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1360-05

2013-09-17

2014-01-29

*國家科技部“十二五”資助項目中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和信息化體系建設(shè)平臺(2012ZX09304-005)

劉偉(1989-),女,山東濟(jì)南人,碩士,研究方向:中藥質(zhì)量評價及新藥開發(fā)研究。電話:(0)18042323810,E-mail:liuw1989@yeah.net。

祝明(1958-),女,浙江金華人,主任中藥師,碩士生導(dǎo)師,學(xué)士,研究方向:中藥有效成分及質(zhì)量控制研究。電話:0571-86734991,E-mail:zhumingd@hotmail.com。