楊波,周承志,張道亮,胡有志,肖金鳳

(湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院、湖北省中醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430061)

漢黃芩素對高脂血癥小鼠的保護作用

楊波,周承志,張道亮,胡有志,肖金鳳

(湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院、湖北省中醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430061)

目的 研究漢黃芩素對飲食誘導下高脂血癥小鼠模型的防治作用。方法將30只C57小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組和藥物干預組,每組10只。正常對照組給予普通飲食,模型對照組給予高脂飼料,藥物干預組在高脂飼料基礎上添加漢黃芩素500 mg·kg-1。觀察漢黃芩素對模型小鼠血脂、脂代謝關(guān)鍵酶的影響,探討其降脂機制。結(jié)果經(jīng)過12周的高脂飲食,模型小鼠形成了明顯的高脂血癥,體質(zhì)量增加,內(nèi)臟脂肪增多,脂肪指數(shù)增加(P＜0.05)。藥物干預組較模型對照組體質(zhì)量減輕(P＞0.05),內(nèi)臟脂肪明顯減少(P＜0.01),脂肪指數(shù)顯著下降(P＜0.05)。漢黃芩素明顯降低總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),但對三酰甘油(TG)影響不大。藥物干預組較模型對照組肝脂酶(HL)與脂蛋白脂酶(LPL)活性恢復(P＜0.05),羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶活性被抑制(P＜0.01);分子生物學研究顯示其降脂效果可能與脂合成基因(SREBP-1c,FAS,PPARγ)與脂質(zhì)代謝基因(PPARα,CPT-1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。結(jié)論漢黃芩素能夠很好地治療高脂血癥,這一作用可能與調(diào)節(jié)脂酶活性和影響脂質(zhì)合成與氧化基因相關(guān)。

漢黃芩素;高脂血癥;氧化代謝;酶活性

高脂血癥是心血管疾病的高危因素。高脂血癥的危害是隱匿、進行性和全身性的,防治高脂血癥具有非常重要的臨床意義[1-2]。漢黃芩素屬黃酮類化合物,化學名2-羥基-4-甲氧基苯乙酮[3],相比黃芩中其他黃酮化合物,穩(wěn)定性更高,且具有廣譜的抗炎、抗氧化、增強免疫等作用[3]。此外,研究還證實其具有抗變態(tài)反應、降血糖、抗脂質(zhì)過氧化作用[4-5]。因此,結(jié)合其藥理特性,筆者認為漢黃芩素對高脂血癥可能有較好的防治作用。筆者在本研究利用目前公認的高脂血癥小鼠模型探索漢黃芩素對高脂血癥的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性7周齡C57小鼠30只,體質(zhì)量22～24 g,動物合格證號:SCXK(鄂)2011-0007,購于武漢大學動物實驗中心。實驗動物在SPF級動物房寄養(yǎng)[溫度(23±2)℃,濕度(60±5)%],自由飲水、攝食,明暗周期12 h(7∶00～19∶00)。動物使用許可證號為:SYXK(鄂)2004-0019。

1.2 試藥 漢黃芩素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限責任公司,批號:CAS-NO:632-85-9,純度:98%)?？偰懝檀?total cholesterol,TC)試劑盒(批號:F002-2)、三酰甘油(triglycerides,TG)試劑盒(批號:F001-2)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)試劑盒(批號: F003-1),低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)試劑盒(批號:F004-2),均由南京建成生物工程研究所提供。羥甲基戊二酸單酰輔酶A(hydroxy methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶試劑盒(批號:SBJ-M0611)、肝脂酶(hepatic lipase,HL)試劑盒(批號:SBJ-M0206)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)試劑盒(批號:SBJ-M0448),由南京森貝伽生物科技有限公司提供。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天恩澤有限公司(批號:60906-50)。SYBRGreen購于羅氏有限責任公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其余試劑均購自國藥集團,為分析純。飼料來源于北京協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物學部。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立 動物模型的建立參考文獻[6]。所有小鼠先適應性喂養(yǎng)1周。而后隨機分為正常對照組、模型對照組、藥物干預組,每組10只。正常對照組給予普通飲食(脂肪12.4%,碳水化合物68.8%,蛋白質(zhì)18.8%);模型對照組給予高脂飼料(脂肪37.1%,碳水化合物42.4%,蛋白質(zhì)20.5%);藥物干預組在高脂飼料基礎上添加0.5%漢黃芩素(折合劑量為500 mg·kg-1),灌服,共干預12周。實驗期間小鼠自由進食飲水。實驗結(jié)束時,收集血液,離心,取上清液,凍存;剝離肝臟,保存于-80℃冰箱中,用于分子生化檢測。

1.3.2 血脂檢測 取血清500 μL,根據(jù)試劑盒操作步驟檢測TC、TG、HDL、LDL。

1.3.3 檢測脂代謝的關(guān)鍵酶 血清脂代謝關(guān)鍵酶的檢測,包括:HL、LPL與HMG-CoA還原酶,按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 Real-time PCR檢測肝臟從頭合成途徑基因用Trizol Reagent試劑盒提取肝臟總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。引物序列為:PPAR-α,F:TGGGGATGAAGAGGGCTGAG,R:GGGGACTGCCGTTGTCTGT;PPARγ,F:CAGGCTTGCTGAACGTGAAG,R:GGAGCACCTTGGCGAACA;SREBP-1c,F:CACTTCTGGAGACATCGCAAAC,R:ATGGTAGACAACAGCCGCATC; FAS,F:CTGCGGAAACTTCAGGAAATG,R:GGTTCGGAATGCTATCCAGG;CPT-1,F:AGGACCCTGAGGCATCTATT,R:ATGACCTCCTGGCATTCTCC;GAPDH,F:T-CACCACCATGGAGAAGGC,R:GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA。熒光定量PCR進行擴增,按照兩步法SYBR Real Time-PCR Kit(Roche)試劑盒說明書配制反應體系;溫度循環(huán)參數(shù):預變性95℃,10 min; 95℃,5 s;59℃,30 s;72℃,1 min。40個循環(huán)進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增反應。每組取3個樣本,每個樣本點3個復孔,即每組9個數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0版統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準誤(±s)表示,多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 經(jīng)過12周的高脂飲食誘導,模型對照組小鼠出現(xiàn)明顯的肥胖,表現(xiàn)為:體質(zhì)量增加,內(nèi)臟脂肪增多,脂肪指數(shù)增加(t分別為3.799 6,5.718 1, 4.895 1,P＜0.01)。而藥物干預后,小鼠體質(zhì)量減輕,但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.694 5,P＞0.05),內(nèi)臟脂肪明顯減少(t=3.2937,P＜0.01),且相應脂肪指數(shù)顯著下降(t=2.2948,P＜0.05),見表1。

表1 3組小鼠一般情況比較Tab.1 Comparison of general condition among three groups of mice ±s

表1 3組小鼠一般情況比較Tab.1 Comparison of general condition among three groups of mice ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.01;與模型對照組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compare with normal control group,*1P＜0.01;Compare with model control group,*2P＜0.01,*3P＜0.05

組別小鼠/只體質(zhì)量內(nèi)臟脂肪g內(nèi)臟脂肪指數(shù)/ ×10-2正常對照組1023.33±1.681.34±0.105.22±0.15模型對照組1034.68±2.47*12.67±0.21*16.95±0.32*1藥物干預組1029.12±2.161.82±0.15*25.72±0.43*3

2.2 漢黃芩素改善高脂誘導的高脂血癥 高脂飲食誘導模型對照組小鼠出現(xiàn)明顯的高脂血癥,4項血脂指標均顯著升高(t=2.356 7,2.802 5,2.195 0,3.568 9,P＜0.05)。漢黃芩素干預可以明顯降低TC、LDL、HDL(t= 2.149 7,2.161 9,2.294 3,P＜0.05),但對血清TG影響不大(t=0.814 3,P＞0.05),說明漢黃芩素的降脂效果是通過降低TC而非TG實現(xiàn)的(表2)。

2.3 漢黃芩素對脂代謝關(guān)鍵酶的影響 結(jié)果見表3。高脂飲食誘導后模型對照組HL與LPL活性明顯降低(t=2.114 3,2.327 6,P＜0.05),而HMG-CoA還原酶活性增強(t=2.861 7,P＜0.05),漢黃芩素干預后HL與LPL活性得到恢復(t=3.087 6,2.468 9,P＜0.05), HMG-CoA還原酶活性被抑制(t=2.9150,P＜0.01)。

2.4 漢黃芩素降脂作用的機制 采用Real-time PCR驗證漢黃芩素對脂代謝相關(guān)靶基因的影響。由圖1可知,高脂飲食誘導從頭合成通路的關(guān)鍵靶基因SREBP-1c、FAS mRNA分別上調(diào)446%(t=5.085 9,P＜0.01), 339%(t=4.547 6,P＜0.01),而介導脂質(zhì)合成的另一通路的開關(guān)基因PPARγmRNA亦顯著上升約為287%(t=3.285 0,P＜0.01)。有關(guān)脂質(zhì)氧化代謝的基因PPARα及CPT-1則分別下調(diào)56%(t=3.585 0,P＜0.01),39%(t=2.623 4,P＜0.05)。漢黃芩素干預后相應靶基因均有所恢復。

表2 3組小鼠血清TG、TC、LDL和HDL檢測值Tab.2 Determination on blood TG,TC,LDL and HDL of three groups of mice mmol·L-1,±s

表2 3組小鼠血清TG、TC、LDL和HDL檢測值Tab.2 Determination on blood TG,TC,LDL and HDL of three groups of mice mmol·L-1,±s

與正常對照組比較,*1P＜0.05;與模型對照組比較,*2P＜0.05Compare with normal control group,*1P＜0.05;Compare with model control group,*2P＜0.05

TGTCLDLHDL正常對照組組別小鼠/只100.75±0.122.18±0.420.52±0.101.34±0.15模型對照組101.32±0.21*14.01±0.50*10.88±0.13*12.32±0.23*1藥物干預組101.10±0.172.62±0.41*20.55±0.08*21.69±0.15*2

表3 3組小鼠脂代謝關(guān)鍵酶測定值Tab.3 Determination on key enzymes of lipid metabolism in three groups of mice ±s

表3 3組小鼠脂代謝關(guān)鍵酶測定值Tab.3 Determination on key enzymes of lipid metabolism in three groups of mice ±s

與正常對照組比較,*1P＜0.05;與模型對照組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compare with normal control group,*1P＜0.05;Compare with model control group,*2P＜0.05,*3P＜0.01

組別小鼠/只HL/ (U·mL-1) LPL/ (U·L-1) HMG-CoA還原酶/ (nmol·min-1·mg-1)正常對照組107.64±1.0216.23±2.132.21±0.18模型對照組104.39±1.15*18.28±2.67*12.98±0.20*1藥物干預組109.68±1.27*217.94±2.86*31.88±0.32*2

3 討論

高脂血癥是機體脂質(zhì)代謝紊亂的重要臨床表現(xiàn),也是冠心病、糖尿病、代謝綜合征等的發(fā)病基礎。降血脂藥物開發(fā)成為該領(lǐng)域的研究熱點。目前越來越多的研究表明,黃酮類化合物有較好的降血脂作用,可改善脂質(zhì)代謝,阻止脂質(zhì)過氧化的鏈式擴增反應,從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。

漢黃芩素來源于黃芩的根,也可見于半枝蓮的根莖,其成分單一、藥理作用明確、毒副反應小,安全性高[3]。從實驗可以看出,漢黃芩素對小鼠高脂血癥具有明顯的防治作用,主要是通過降低TC而實現(xiàn),對TG影響不大。研究結(jié)果證實漢黃芩素可顯著增加HL與LPL的活性,同時降低HMG-CoA的活性。HL具有TG脂肪酶、甘油一酯脂肪酶、磷脂酶等多個活性[9]。LPL則廣泛分布于毛細血管內(nèi)皮細胞表面,它能與肝素結(jié)合成復合物,脫離后催化乳糜微粒與VLDL中的TG水解為甘油和脂肪酸[10]。HMG-CoA還原酶則是由NADPH供氫催化乙酰CoA生成甲羥戊酸,是合成膽固醇的限速酶。抑制HMG-CoA還原酶活性可減少膽固醇合成,進而消耗儲存的膽固醇,還可促使肝臟細胞增加LDL-C受體的數(shù)量與活性,最終降低血中總膽固醇及LDL[11]。而高脂飲食誘導小鼠HDL升高,是因為小鼠的血脂譜與人類不同,小鼠的HDL相當于人類的LDL,因此漢黃芩素可降低相應的HDL血清水平。

A.脂質(zhì)從頭合成通路上靶基因的改變;B.PPARα與CPT-1mRNA的變化。與正常對照組比較,*1P＜0.01,*4P＜0.05;與模型對照組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01圖1 漢黃芩素對高脂血癥的作用機制(n=9)A.Changes of target genes in lipid synthesis pathway;B.The changes of PPAR α and CPT-1mRNA.Compare with normal control group,*1P＜0.01,*4P＜0.05;Compare with model control group,*2P＜0.05,*3P＜0.01Fig.1 Mechanism of wogonin on hyperlipidemia(n=9)

由于脂質(zhì)的合成與代謝處于一個動態(tài)平衡,為此檢測脂質(zhì)合成的關(guān)鍵基因(SREBP-1c、FAS、PPARγ)及脂質(zhì)氧化代謝的關(guān)鍵基因(PPARα、CPT-1)。SREBP-1c及其靶基因FAS介導了脂質(zhì)的從頭合成途徑:從乙酰輔酶A合成至長鏈脂肪酸[12];而PPARγ則介導了脂質(zhì)的其他合成路徑,許多與脂代謝合成、轉(zhuǎn)運、分解的基因均與它有密切關(guān)系,并參與到脂肪細胞的分化[13]。高表達的PPARγ能加強CD36、AP2及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)等靶基因的上調(diào)[13]。本研究結(jié)果顯示漢黃芩素降低了高脂飼料誘導下兩靶基因的上調(diào),說明其脂質(zhì)合成抑制作用至少是雙靶點調(diào)控,而對PPARγ的抑制也解釋了減肥效應的緣由。而PPARα及其靶基因CPT-1則與脂質(zhì)的氧化代謝密切相關(guān)[14],在漢黃芩素干預后PPARα顯著上調(diào)。因此,筆者推測漢黃芩素的降脂作用是依賴于減少脂質(zhì)合成和增加脂質(zhì)氧化而實現(xiàn)的。

綜上所述,本研究顯示漢黃芩素對高脂血癥有很好的防治效果,這一作用可能與其調(diào)控脂代謝關(guān)鍵酶活性、抑制脂質(zhì)合成與增加脂質(zhì)氧化代謝相關(guān)。

[1] JAIN K S,KATHIRAVAN M K,SOMANI R S,et al.The biology and chemistry of hyperlipidemia[J].Bioorg Med Chem,2007,15(14):4674-4699.

[2] BERTOLOTTI M,MAURANTONIO M,GABBI C,et al. Review article:hyperlipidaemia and cardiovascular risk [J].Aliment Pharmacol Ther,2005,22(Suppl 2):28-30.

[3] TAI M C,TSANG S Y,CHANG L Y,et al.Therapeutic potential of wogonin:a naturally occurring flavonoid[J]. CNS Drug Rev,2005,11(2):141-150.

[4] LI-WEBER M.New therapeutic aspects of flavones:the anticancer properties of Scutellaria and its main active constituents Wogonin,Baicalein and Baicalin[J].Cancer Treat Rev,2009,35(1):57-68.

[5] LIM B O,CHOUE R W,LEE H Y,et al.Effect of the flavonoid components obtained from Scutellaria radix on the histamine,immunoglobulin E and lipid peroxidation of spleen lymphocytes of Sprague-Dawley rats[J].Biosci Biotechnol Biochem,2003,67(5):1126-1129.

[6] PU P,GAO D M,MOHAMED S,et al.Naringin ameliorates metabolic syndrome by activating AMP-activated protein kinase in mice fed a high-fat diet[J].Arch Biochem Biophys,2012,518(1):61-70.

[7] PROCHAZKOVA D,BOUSOVA I,WILHELMOVA N. Antioxidant and prooxidant properties of flavonoids[J]. Fitoterapia,2011,82(4):513-523.

[8] PRASAIN J K,CARLSON S H,WYSS J M.Flavonoids and age-related disease:risk,benefits and critical windows[J]. Maturitas,2010,66(2):163-171.

[9] PERRET B,MABILE L,MARTINEZ L,et al.Hepatic lipase:structure/functionrelationship,synthesis,and regulation[J].J Lipid Res,2002,43(8):1163-1169.

[10] MERKEL M,ECKEL R H,GOLDBERG I J.Lipoprotein lipase:genetics,lipid uptake,and regulation[J].J Lipid Res,2002,43(12):1997-2006.

[11] SINGH N,TAMARIZ J,CHAMORRO G,et al.Inhibitors of HMG-CoA reductase:current and future prospects[J].Mini Rev Med Chem,2009,9(11):1272-1283.

[12] KOTZKAJ,MULLER-WIELANDD.Sterolregulatory element-binding protein(SREBP)-1:gene regulatory target for insulin resistance?[J].Exp Opin Ther Targets,2004,8 (2):141-149.

[13] MATSUZAWA-NAGATA N,TAKAMURA T,ANDO H,et al.Increased oxidative stress precedes the onset of high-fat diet-inducedinsulinresistanceandobesity[J]. Metabolism,2008,57(8):1071-1077.

[14] KIDANI Y,BENSINGER S J.Liver X receptor and peroxisome proliferator-activated receptor as integrators of lipid homeostasis and immunity[J].Immunol Rev,2012, 249(1):72-83.

DOI 10.3870/yydb.2014.10.014

Protection Effect of Wogonin on Mice with Hyperlipidemia

YANG Bo,ZHOU Cheng-zhi,ZHANG Dao-liang,HU You-zhi,XIAO Jin-feng
(Department of Cardiology, Hospital Affiliated to Hubei University of Chinese Medicine,Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430061,China)

ObjectiveTo explore the effects of wogonin on hyperlipidemia in mice and clarify the molecule mechanism.MethodsThirty mice were evenly divided into three groups:normal control group,model control group and treatment group.The normal control group was given normal diet,the model control group received high-fat diet,the treatment group received high-fat diet with wogonin(500 mg·kg-1).ResultsThe mice developed hyperlipidemia 12 weeks after starting the high-fat diet.The body weight,visceral fat and fat index were increased(P＜0.05).After treatment,these indices were reduced(P＜0.01).Wogonin significantly reduced the total cholesterol(TC),low density lipoprotein(LDL),high density lipoprotein(HDL),except the triglyceride(TG).Compared to the model control group,the hepatic lipase(HL)and lipoprotein lipase(LPL)activity in the treatment group were recovered(P＜0.05),but HMG-CoA reductase activity was inhibited(P＜0.01).Mechanistic study suggested that the lipid-lowering effect might be related to the lipid synthesis genes(SREBP-1c,FAS, PPARγ)and the lipid metabolism genes(PPARα,CPT-1).ConclusionWogonin can prevent hyperlipidemia,which might be related to the regulation of enzyme activity and the changes of lipid synthesis and oxidative metabolism.

Wogonin;Dyslipidemia;Oxidative metabolism;Enzyme activity

R965

A

1004-0781(2014)10-1310-04

2013-07-29

2013-10-29

楊波(1978-),男,安徽桐城人,講師,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:心血管疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療。電話:(0) 13307182140,E-mail:yangbotougao@163.com。

周承志(1974-),男,湖北武漢人,副教授,副主任醫(yī)師,博士,研究方向:中西醫(yī)結(jié)合治療心腦血管疾病。電話:(0)18971328697,E-mail:acheng8341@163.com。