胡少明,張瀛,陶秀良,熊麗萍

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430030;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院病理科,武漢 430070)

不同濃度雄黃對(duì)胃腺癌細(xì)胞凋亡的影響

胡少明1,張瀛1,陶秀良1,熊麗萍2

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430030;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院病理科,武漢 430070)

目的 觀察不同濃度雄黃對(duì)體外胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)0,10,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃對(duì)胃腺癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制率的影響;采用膜聯(lián)蛋白Ⅴ/碘化丙啶雙染色法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)0,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果10,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃在24和48 h對(duì)SGC-7901細(xì)胞株的抑制率分別為6.15%,7.54%,42.31%,63.54%以及32.56%,46.14%,64.51%,87.52%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24和48 h后細(xì)胞半數(shù)抑制濃度分別約45.23,15.34 μg·mL-1。0,20,50,80 μg·mL-1濃度雄黃作用24 h后誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡率依次為(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%,(25.81±2.68)%,(43.62±8.51)%,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);晚期凋亡率依次為(1.84±0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%,(5.00±0.10)%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論高純度雄黃可抑制胃腺癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡。

雄黃;胃腺癌;細(xì)胞凋亡

胃癌(gastric cancer,GC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2013年美國(guó)約有21 600例新發(fā)胃癌病例,其中男13 230例,女8 370例;并預(yù)期有6 740例男性及4 250例女性胃癌患者死亡[1]。胃癌的流行病學(xué)有明顯的地域差異,美國(guó)及澳洲發(fā)病率低,日本、丹麥以及發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高。我國(guó)屬胃癌高發(fā)地區(qū),由于人口基數(shù)大,我國(guó)每年新發(fā)胃癌病例數(shù)占全球的比例40%或40%以上[2],并且具有早期診斷率低、晚期比例大、病死率高和生存率低等特點(diǎn)。由于中晚期胃癌單純依靠手術(shù)難以根治,化學(xué)治療(化療)聯(lián)合分子靶向藥物日益成為晚期胃癌的主要治療方法。胃癌雖對(duì)化療相對(duì)敏感,但由于胃癌疾病異質(zhì)性強(qiáng),目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)治療方案,即便采用表柔比星+順鉑+氟尿嘧啶(ECF)、多西他賽+順鉑+氟尿嘧啶(DCF)、奧沙利鉑+亞葉酸鈣+氟尿嘧啶(FOLFOX)等新含鉑聯(lián)合化療方案及分子靶向治療,晚期胃癌患者的5年總生存率仍令人失望。因此,發(fā)掘新的有效治療藥物勢(shì)在必行。雄黃為硫化物類礦物,在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中既往多用于治療癰腫療瘡、蛇蟲(chóng)咬傷、蟲(chóng)積腹痛、驚

和瘧疾等。隨著砒霜(As2O3)在治療惡性腫瘤方面取得諸多成果,與之同屬砷劑的另一天然化合物雄黃開(kāi)始引起人們的關(guān)注。近年研究結(jié)果表明,雄黃除具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、抗病毒等作用外,尚有一定的抗腫瘤效應(yīng)[3]。筆者在本研究擬觀察不同濃度高純度雄黃體外對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響,探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑與儀器 雄黃粉(購(gòu)自湖北省中藥材公司,經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部魏世超副主任藥師鑒定為硫化物類礦物雄黃族雄黃),DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司,批號(hào):NWM0542),胎牛血清(杭州四季青公司,批號(hào):120112),乙二胺四醋酸(Ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-胰蛋白酶消化液、雙抗溶液(青霉素∶鏈霉素=1∶1)(湖北百奧斯生物科技有限公司),四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]試劑盒,Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào):C0009,C1063),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BDFACS Aria)。

1.3 高純度雄黃的制備 將雄黃及水按體積比1∶2用星式球磨機(jī)球磨72 h,制備雄黃微細(xì)粉末,加水研磨5 min,再加水?dāng)嚢? min,644×g離心2 min,倒出上清液,重復(fù)3次后再用無(wú)水乙醇洗3次;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥后60℃真空減壓干燥制備干燥雄黃粉末,純度大于98%。氯化鉀飽和硝酸溶液溶解,氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)定容,配成2 mg·mL-1的儲(chǔ)備液,經(jīng)篩孔內(nèi)徑0. 22 μm濾膜過(guò)濾除菌后,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將加入細(xì)胞培養(yǎng)液的胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901置于5%二氧化碳(CO2)、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),用EDTA-胰蛋白酶消化液消化后收集細(xì)胞并傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)液配置:DMEM高糖培養(yǎng)液90 mL,添加雙抗溶液(青霉素100U·mL-1,鏈霉素100 μg·mL-1)1 mL,胎牛血清10 mL,使血清終濃度為10%。

1.5 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞消化后稀釋成5×104個(gè)·mL-1,接種于96孔板,每孔為100 μL。設(shè)置空白對(duì)照組(調(diào)零孔)、陰性對(duì)照組(不加藥物的細(xì)胞)和4個(gè)藥物組,每組設(shè)復(fù)孔6個(gè)。每次種板2塊(兩個(gè)時(shí)限)。將2 mg·mL-1雄黃藥物儲(chǔ)備液以DMEM高糖培養(yǎng)液配成濃度梯度10,20,50,80 μg·mL-1。將配制各濃度雄黃溶液于藥物組每孔加100 μL,96孔板周圍加入PBS 100 μL以消除邊緣效應(yīng)。分別置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育24,48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT工作液50 μL,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。細(xì)胞板底肉眼可見(jiàn)少量紫色結(jié)晶,顯微鏡下觀察部分細(xì)胞周圍有絲狀結(jié)晶狀物質(zhì),用100 μL移液槍小心吸去上清液,保留底部紫色結(jié)晶,然后加入溶液A 100 μL, 37℃孵育15 min,待紫色結(jié)晶完全溶解。

酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度(A)值,并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率(%)=[1-(藥物組A值-本底A值)/(陰性對(duì)照組A值-本底A值)]× 100%(本底為無(wú)細(xì)胞無(wú)藥物的調(diào)零孔)。重復(fù)3次取平均值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好細(xì)胞同前法消化,將稀釋至1×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞種于6孔板,每孔2 mL。分為陰性對(duì)照組及3個(gè)藥物組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。DMEM高糖培養(yǎng)液配制20,50,80 μg·mL-1濃度梯度雄黃溶液備用。細(xì)胞貼壁后取出,PBS洗滌3次,棄PBS,分別加入新配制的各濃度雄黃溶液,每孔2 mL,陰性對(duì)照組加DMEM高糖培養(yǎng)液2 mL作為對(duì)照,標(biāo)記后平放入恒溫箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)時(shí)限結(jié)束的細(xì)胞,用不含EDTA的胰酶消化液消化細(xì)胞3 min,鏡下觀察細(xì)胞間隙出現(xiàn)時(shí),完全培養(yǎng)液終止消化,吹打下全部細(xì)胞,收集于離心管內(nèi),于644×g離心5 min,棄上清液,PBS洗2次,再離心棄上清液。加入去離子水稀釋后的Binding Buffer(4∶1)500 μL入離心管,懸浮細(xì)胞。加入熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin V-FITC)5 μL混勻后,再加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15 min后于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS19.0版軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,MTT數(shù)據(jù)組間比較用多因素方差分析,流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡率比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用 MTT法檢測(cè)表明,高純度雄黃呈時(shí)間和劑量依賴性抑制SGC-7901細(xì)胞增殖,各組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表1。24,48 h后細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(half inhibitoryconcentration,IC50)分別約45.23, 15.34 μg·mL-1。

2.2 對(duì)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)MTT試驗(yàn)結(jié)果選擇24 h為作用時(shí)限,SGC-7901細(xì)胞經(jīng)0,20,50,80 μg·mL-1高純度雄黃作用24 h,細(xì)胞早期凋亡率依次分別為(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%, (25.81±2.68)%,(43.62±8.51)%,凋亡率隨雄黃濃度升高呈濃度依賴性,各濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);晚期凋亡及壞死率依次為(1.84± 0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%,(5.00± 0.10)%,晚期凋亡及壞死細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加,但各濃度組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。流式檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度雄黃對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用Tab.1 Growth inhibition of different concentrations of realgar on the SGC-7901 cells ±s

表1 不同濃度雄黃對(duì)SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用Tab.1 Growth inhibition of different concentrations of realgar on the SGC-7901 cells ±s

與0 μg·mL-1比較,*1P＜0.05;與24 h比較,*2P＜0.05Compared with 0 μg·mL-1group,*1P＜0.05;Compared with the same concentration group at 24 h,*2P＜0.05

濃度/ (μg·mL-1) 24 hA值抑制率/% 48 hA值抑制率/% 87.52 00.666±0.0990.000.495±0.0020.00 100.626±0.014*16.150.339±0.027*1*232.56 200.617±0.005*17.540.274±0.008*1*246.14 500.291±0.196*142.310.186±0.112*1*264.51 800.253±0.009*163.540.061±0.023*1*2

3 討論

我國(guó)為胃癌高發(fā)地區(qū),胃癌年患病率和病死率均為世界平均水平的2倍多[4]。由于我國(guó)胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期,即使采用包括姑息手術(shù)、放射治療(放療)、化療、分子靶向治療等綜合治療手段,5年生存率依然低下。因此,積極尋找有效治療胃癌的藥物仍是目前亟需解決的重要難題。

圖1 不同濃度雄黃作用SGC-7901細(xì)胞24 h后凋亡變化Fig 1 Apoptosis of SGC-7901 cells 24 h after treatment with different concentrations of realgar

雄黃為硫化物類礦物雄黃族雄黃,主含二硫化二砷(As2S2或As4S4),在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有悠久的使用歷史?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),雄黃對(duì)人類多種腫瘤如白血病[5]、多發(fā)性骨髓瘤[6]、淋巴瘤[7]、宮頸癌[8]、膠質(zhì)瘤[9]、肺癌[10]、肝癌[11]、卵巢癌[12]等都具有明顯的抗腫瘤作用,其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、抗腫瘤血管形成、調(diào)節(jié)基因表達(dá)有關(guān),顯示良好的應(yīng)用前景。然而,雄黃難溶于水,傳統(tǒng)的處理工藝如水飛、酸洗、酸奶洗等雖使用多年,但未能解決雄黃的溶解度問(wèn)題。臨床上雄黃仍以粗糙的原粉入藥,這種單一的給藥方式,嚴(yán)重影響其在體內(nèi)的吸收和分布,限制了臨床應(yīng)用范圍。近年來(lái),國(guó)內(nèi)曾有學(xué)者試圖采用納米技術(shù)解決難溶性雄黃的生物利用度問(wèn)題,降低毒副作用[13]。本實(shí)驗(yàn)采用高能球磨法制備雄黃微細(xì)粉末[14],可使制備的雄黃粉末粒徑達(dá)到納米級(jí)分布,并可通過(guò)淘洗除去可溶性雜質(zhì)三氧化二砷及有機(jī)物雜質(zhì),是目前解決難溶性雄黃的生物利用度的較理想方法。

本研究結(jié)果表明,雄黃對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901具有明顯的抑制作用,并呈濃度及時(shí)間依賴性,而對(duì)細(xì)胞凋亡周期的影響主要體現(xiàn)在抑制細(xì)胞早期凋亡。凋亡指該類細(xì)胞的死亡形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞核裂解,然后被細(xì)胞質(zhì)包繞,形成凋亡小體,再被其他細(xì)胞吞噬清除,尤如樹(shù)葉凋落,周圍沒(méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),不出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞壞死則是指通過(guò)炎癥反應(yīng)徹底破壞細(xì)胞內(nèi)成分,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。近年來(lái)對(duì)抗腫瘤藥物選擇到底是期待凋亡還是壞死存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為對(duì)于選擇腫瘤藥物,如果藥物導(dǎo)致細(xì)胞大量壞死則正常細(xì)胞亦難以承受,將會(huì)降低藥物安全度。亦有學(xué)者認(rèn)為治療腫瘤應(yīng)該利用“細(xì)胞壞死誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)”機(jī)制,并稱部分腫瘤患者在罹患嚴(yán)重感染后腫瘤“自發(fā)性消退”可能通過(guò)該類機(jī)制[15]。本研究發(fā)現(xiàn),增加雄黃濃度并不會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞晚期凋亡及壞死細(xì)胞明顯增多,表明雄黃在腫瘤治療中主要表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞的早期凋亡,細(xì)胞壞死少,藥物安全性相對(duì)高,但尚需進(jìn)一步行動(dòng)物體內(nèi)藥物試驗(yàn)評(píng)估其效價(jià)的優(yōu)劣。

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.013

Effects of Different Concentrations of Realgar on the Apoptosis of Gastric Adenocarcinoma Cells

HU Shao-ming1,ZHANG Ying1,TAO Xiu-liang1,XIONG Li-ping2
(1.Department of Integrated Traditional Chinese Medicine&Western Medicine,Tongji Hospital Affiliated with Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Department of Pathology,Wuhan General Hospital of Guangzhou Command,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo observe the effect of different concentrations of realgar on the apoptosis of gastric adenocarcinoma cell Line SGC-7901.MethodsMTT assay was conducted to detect the growth inhibition ratio of SGC-7901 cells treated by different concentrations of realgar(0,10,20,50 and 80 μg·mL-1).AnnexinⅤ/Propidium iodide double staining method together with flow cytometry were used to detect the effect of realgar at 0,20,50 and 80 μg·mL-1on the apoptosis of SGC-7901 cells.ResultsThe growth inhibition ratio of SGC-7901 cells by various concentrations of high-purity realgar(10,20,50 and 80 μg·mL-1)was 6.15%,7.54%,42.31%and 63.54%,respectively,24 h after realgar treatment.At 48 h after the treatment,the growth inhibition ratio rose to 32.56%,46.14%,64.51%and 87.52%,respectively(P＜0.05).Half inhibitory concentration was 45.23 μg·mL-1after 24 h and 15.34 μg·mL-1after 48 h.After treated by various concentrations of pure realgar(0,20,50 and 80 μg·mL-1)for 24 h,early cell apoptosis rate was(11.10±2.10)%,(15.31±1.30)%,(25.81±2.68)%and(43.62± 8.51)%,respectively,significantly different among the four groups(P＜0.05).The late cell apoptosis rate in each group was (1.84±0.25)%,(4.41±0.09)%,(4.37±0.14)%and(5.00±0.10)%,respectively(P＞0.05).ConclusionHigh purity realgar can inhibit the proliferation and induce early apoptosis of gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells.

Realgar;Gastric adenocarcinoma;Apoptosis

R285.5;R965

A

1004-0781(2014)10-1306-04

2014-02-18

2014-04-20

胡少明(1955-),男,湖北武漢人,主任醫(yī)師,學(xué)士,研究方向:腫瘤中西醫(yī)結(jié)合治療。電話:027-83663217,E-mail:smhu@tjh.tjmu.edu.cn。

熊麗萍(1972-),女,江西九江人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:腫瘤病理學(xué)。電話:027-50772675,E-mail:ripplexiong@hotmail.com。