韋文芳

(南寧市第四人民醫(yī)院藥劑科,南寧 530023)

鵝不食草中槲皮素和山奈酚的含量測(cè)定

韋文芳

(南寧市第四人民醫(yī)院藥劑科,南寧 530023)

目的 建立鵝不食草藥材中槲皮素、山奈酚的高效液相色譜(HPLC)含量測(cè)定方法。方法ZORBAX SBC18(4.6 mm×250 mm,5μm),流動(dòng)相:甲醇-0.2%磷酸(45∶55),檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm,流速0.8 mL·m in-1,柱溫30℃。結(jié)果槲皮素進(jìn)樣量在0.089 0～1.780 0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.000 0),山奈酚進(jìn)樣量在0.071 0～1.420 0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9),槲皮素平均加樣回收率為98.94%,RSD=1.95%(n=9),山奈酚平均加樣回收率為99.76%,RSD=2.35%(n=9)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、易于操作,結(jié)果準(zhǔn)確,重復(fù)性好。

鵝不食草;槲皮素;山奈酚;色譜法,高效液相;含量測(cè)定

鵝不食草為菊科植物鵝不食草[Centipeda minima(L.)A.Br.et Aschers.]的干燥全草。具有發(fā)散風(fēng)寒、開(kāi)鼻竅、止咳的功效,臨床上主要用于治療風(fēng)寒頭痛,咳嗽痰多,鼻塞不通,鼻淵流涕[1]。已知其主要成分為黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、甾體類(lèi)、揮發(fā)油和有機(jī)酸,還含有百里香酚類(lèi)衍生物。鵝不食草中黃酮類(lèi)成分主要以槲皮素衍生物的形式存在[2],也包括槲皮素和山奈酚。其藥理作用主要有抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、護(hù)肝及對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)等[3-5]。目前筆者尚未見(jiàn)鵝不食草中槲皮素和山奈酚含量測(cè)定的報(bào)道,故建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定其含量,報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀:Shimadzu-ProminenceHPLC(Shimadzu公司),包括LC-20A輸液泵、SPDM20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、LCsolution工作站;數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DB型(昆山市超聲儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-1001N(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);水浴鍋WB-2000(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);電子天平XS205DU(梅特勒-托利多公司)。0.45μm微孔濾膜。

1.2 試藥 槲皮素對(duì)照品(含量＞98%,批號(hào):110860-200406)、山奈酚對(duì)照品(含量＞98%,批號(hào):110861-200304),均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;鵝不食草(批號(hào):20120725,20120916,20121219),購(gòu)于廣西桂林,并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)副教授鑒定為菊科植物鵝不食草[Centipedaminima(L.)A.Br.et Aschers.]的干燥全草。甲醇為色譜純,乙醇、鹽酸均為分析純,水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 分別稱(chēng)取槲皮素對(duì)照品4.45 mg、山奈酚對(duì)照品3.55 mg,精密稱(chēng)定,分別加甲醇使溶解,定容在10 mL棕色量瓶中,配成濃度分別為0.445,0.355 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取上述兩種溶液各1 mL,置同一個(gè)5 m L棕色量瓶中,甲醇定容,得混合對(duì)照品溶液,混合對(duì)照品溶液中每毫升含槲皮素0.089 mg,山奈酚0.071 mg,備用。

2.2 樣品溶液的制備 將干燥的鵝不食草粉碎,過(guò)篩孔內(nèi)經(jīng)0.425 mm(40目)篩,取鵝不食草粉末約2 g,精密稱(chēng)定,置150 m L錐形瓶中,加90%甲醇50 m L,超聲(100 Hz)提取60 min,過(guò)濾,濾液中加入30%鹽酸約15 mL,加熱回流水解2 h,減壓蒸干,放冷,殘留物加甲醇分次溶解,定容至10 mL,經(jīng)微孔濾膜濾過(guò),得樣品溶液。

2.3 色譜條件 采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm,5μm)為色譜柱,柱溫30℃,以甲醇-0.2%磷酸(45∶55)為流動(dòng)相,流速0.8 m L·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm。在此色譜條件下鵝不食草中槲皮素與山奈酚分離良好,理論板數(shù)按槲皮素、山奈酚峰計(jì)均＞3 500,分離度均＞1.5,槲皮素保留時(shí)間約為25 min,山奈酚保留時(shí)間約為46 min,所得圖譜見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液按上述色譜條件分別進(jìn)樣1,4,8,12,16,20μL,測(cè)定槲皮素、山奈酚的峰面積,以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y),樣品進(jìn)樣量(X,μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,槲皮素:Y=4.9×106X-31 777,r=0.999 9,線性范圍0.089 0～1.780 0μg;山奈酚:Y=5×106X-44 018,r=0.999 9,線性范圍0.071 0～1.420 0μg。結(jié)果表明,在線性范圍內(nèi),槲皮素、山奈酚進(jìn)樣量與峰面積均呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)得槲皮素峰面積RSD= 0.55%;山奈酚峰面積RSD=0.35%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。

1.槲皮素;2.山奈酚圖1 混合對(duì)照品(A)與樣品(B)HPLC圖

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批鵝不食草粉末,精密稱(chēng)取6份約2 g,照“2.2”項(xiàng)樣品溶液制備方法操作,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,外標(biāo)法計(jì)算槲皮素和山奈酚含量。測(cè)得槲皮素平均含量為0.098 13 mg·g-1,RSD=1.52%;山奈酚平均含量為0.085 93 mg·g-1,RSD=1.50%。結(jié)果表明,其重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別于0,2,4,8,10,12 h吸取樣品溶液注入色譜儀,測(cè)定峰面積。樣品槲皮素RSD= 0.87%,山奈酚RSD=1.42%。結(jié)果表明,其穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的鵝不食草(批號(hào):20121219)粉末約1 g,精密稱(chēng)定,分3組,每組3份,分別加入混合對(duì)照品溶液2.0,2.5,3.0 m L,按照樣品溶液制備方法制備供試品溶液,共9份,按上述色譜條件測(cè)定其含量,計(jì)算回收率,槲皮素平均回收率為98.94%,RSD=1.95%,山奈酚平均回收率為99.76%,RSD=2.35%,結(jié)果見(jiàn)表1,2。

2.9 含量測(cè)定 精密稱(chēng)取3批鵝不食草粉末(批號(hào): 20120725,20120916,20121219),每批3份,每份約2 g,照“2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備方法操作,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,記錄峰面積,外標(biāo)法測(cè)定其含量,結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 槲皮素、山奈酚均為黃酮化合物,槲皮素最大吸收波長(zhǎng):帶Ⅰ376 nm,帶Ⅱ256 nm;山奈酚最大吸收波長(zhǎng):帶Ⅰ370 nm,帶Ⅱ267 nm[6]。為了便于同時(shí)測(cè)定,選二者的光譜交點(diǎn)370和260 nm進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、山奈酚的甲醇溶液在370 nm處吸收好,與其他組分有較好的分離,故選定370 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 槲皮素和山奈酚加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-0.2%磷酸體系來(lái)分離,考察甲醇-0.2%磷酸40∶60,45∶55,48∶52, 50∶50,60∶40,綜合考慮分離度、峰形、回收率等因素,確立以甲醇-0.2%磷酸(45∶55)為流動(dòng)相分離最好,確定流速為0.8 mL·min-1。針對(duì)中藥材的特殊性,加裝了預(yù)柱,以保護(hù)色譜柱,提高分析方法的準(zhǔn)確性。

3.3 提取方法的選擇 考察提取時(shí)間20,30,40,60, 120 min,結(jié)果以每次超聲60 min為最佳,還考察提取溶劑乙醇、甲醇,最后確立甲醇為提取溶劑,考察30%,50%,70%,90%,100%不同濃度甲醇的超聲提取,結(jié)果以90%甲醇提取最佳,最后考察鹽酸的加入量15,20,25,30 mL,結(jié)果15 mL鹽酸即可完全水解,并且若加入的酸過(guò)多,會(huì)腐蝕設(shè)備,故確定鹽酸用量為15 mL。

3.4 系統(tǒng)適用性 在此色譜條件下,槲皮素與山奈酚有足夠大的峰值,基線噪音小,樣品中的槲皮素、山奈酚與其他組分間有較好的分離度。本實(shí)驗(yàn)采用的HPLC法測(cè)定鵝不食草中的槲皮素、山奈酚,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度、樣品穩(wěn)定性、方法的重復(fù)性良好,為鵝不食草中黃酮類(lèi)成分的質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

3.5 藥材含量 鵝不食草廣泛分布于我國(guó)華北、華東、中南、西南地區(qū),主產(chǎn)于湖北、江蘇、浙江、廣東和廣西,野生于田埂、路邊、房前屋后或荒野草地陰濕處[7]。目前從鵝不食草中主要分離得到黃酮、甾體、三萜和愈創(chuàng)木內(nèi)酯類(lèi)化合物。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)鵝不食草中槲皮素、山奈酚含量較低,除提取方法可繼續(xù)改進(jìn)外,其含量還可能與鵝不食草的產(chǎn)地、種植或野生有關(guān)。故在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,后續(xù)工作可進(jìn)一步測(cè)定不同產(chǎn)地種植或野生的鵝不食草中槲皮素、山奈酚的含量,完善鵝不食草的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:326.

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[3] 高玉嬌,梅全喜.鵝不食草的藥理與臨床研究進(jìn)展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2010,3(4):307-309.

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[5] 李樂(lè),呂順忠,唐輝.高效液相色譜法測(cè)定天山花楸葉中槲皮素和山奈素含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(7):928-929.

[6] 李化,于艷秋,楊濱.黃酮化合物與Fe(Ⅱ)絡(luò)合反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2010,16(17):99-100.

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.032

R284.2;R927.2

A

1004-0781(2014)06-0802-03

2013-08-14

2013-09-17

韋文芳(1972-),女,廣西上林人,主管藥師,學(xué)士,研究方向:民族新藥的開(kāi)發(fā)研究。電話(huà):(0)13978679458, E-mail:2227860396@qq.com。