楊麗珍,楊偉峰,,石云峰

(1.浙江工業(yè)大學化學工程學院,杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310004)

高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法分析克拉屈濱注射液中主要雜質及其來源

楊麗珍1,楊偉峰1,2,石云峰2

(1.浙江工業(yè)大學化學工程學院,杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗研究院,杭州 310004)

目的 利用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(HPLC-Q-TOF-MS)法對克拉屈濱注射液的主要雜質進行結構鑒定,并分析其來源。方法色譜柱Grace C18(250mm×4.6mm,5μm),流動相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇(80∶20),柱溫35℃,檢測波長為265 nm。以ESI為離子源,在正離子模式下獲得克拉屈濱及其主要雜質的質譜圖,并推測雜質結構式。分別考察克拉屈濱注射液在pH為4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0溶液及光強為4 500 lx,5%過氧化氫(H2O2),60℃環(huán)境中的穩(wěn)定性。結果通過比較克拉屈濱和主要雜質的裂解途徑及其高分辨質量數(shù),結合合成工藝,推斷出該雜質為2-氯腺嘌呤,由降解試驗推測該雜質可能是克拉屈濱在pH偏低和有氧條件下降解產(chǎn)生。結論HPLC-Q-TOF-MS可快速鑒定克拉屈濱注射液的主要雜質,通過分析雜質的來源,為藥品質量控制和工藝優(yōu)化提供支持。

克拉屈濱注射液;質譜法,高效液相色譜-四極桿飛行時間;鑒定,雜質;分析,雜質來源

克拉屈濱為耐腺苷脫氨酶的脫氧腺苷類似物,為核苷類抗白血病藥,化學名為2-氯-6-氨-9-嘌呤,用于治療毛細胞白血病和Walden-Strom氏巨球蛋白血病,效果顯著,作為2-脫氧核苷類代表性藥物已列為一線藥[1]。在檢驗克拉屈濱注射液的實驗中發(fā)現(xiàn)在相對保留時間為0.63處有一峰面積達0.23%的雜質,人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)要求任何未知雜質當其限度超過0.1%時,應對該雜質進行結構確定和生物安全性驗證[2],而國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)YBH33322005中未對其單獨進行控制[3]。由于藥物的雜質通常與合成工藝和藥物主成分的降解途徑有關,可以對比雜質和主成分的質譜裂解特征來鑒定雜質的化學結構[4],筆者在本實驗利用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,HPLC-Q-TOF-MS)的高分辨率和準確質量數(shù)對克拉屈濱注射液中的主要雜質進行確認。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀(配DAD檢測器)及Agilent 1290高效液相色譜儀(配VWD紫外檢測器)-Agilent6538四極桿飛行時間質譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 試藥 克拉屈濱注射液由浙江海正藥業(yè)有限公司提供(批號:120101,規(guī)格:10 mL∶10 mg),甲醇為色譜純,購自Merck公司(批號:1719107349);乙酸銨(分析純,國藥化學試劑集團,批號:120901);水為超純水,由Milli-Q純水儀(Milli-pore,USA,SAS67120)制得。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Grace-C18柱(250 mm× 4.6 mm,5μm),流動相為10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇(80∶20),流速為1.0 mL·min-1,柱溫為35℃,進樣方式為自動進樣,進樣量為10μL,檢測波長為265 nm[5]。

2.1.2 質譜條件 電噴霧離子源,正離子檢測模式,毛細管電壓4 kV,錐孔電壓65 V,噴霧氣壓0.24 MPa,干燥氣溫度320℃,裂解電壓150 V,氮氣作為干燥氣和霧化氣,分別設為10 mL·min-1和262.0 kPa。樣品從高效液相色譜儀通過T型三通閥以3∶1的分流比引入質譜離子源內。

2.1.3 溶液配制 精密量取克拉屈濱注射液1.0 mL,置100 m L量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋制成質量濃度為10μg·mL-1溶液,作為色譜分析的供試品溶液。取供試品溶液1.0 mL,置100 mL量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋至刻度,作為有關物質自身對照溶液,直接取克拉屈濱注射液作為質譜分析的供試品溶液,濃度為1 mg·m L-1。

2.1.4 穩(wěn)定性影響因素考察 取克拉屈濱注射液分別考察光照、氧化、熱和pH對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響,在規(guī)定條件下放置后,于第5天和第10天分別取1.0 m L,置25 mL量瓶,用甲醇-水(10∶90)稀釋至刻度,按“2.1”項色譜條件進樣分析。

2.2 結果

2.2.1 色譜分析 參照國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)YBH33322005的HPLC條件對克拉屈濱注射液進行有關物質檢測時,發(fā)現(xiàn)相對保留時間0.63處有一較大雜質峰,按歸一化法計算達0.23%;另取色譜分析用供試品溶液按“2.1”項色譜條件進樣,分離效果與國家標準基本一致,見圖1。

2.2.2 質譜分析 在ESI(+)不同能量下,克拉屈濱的二級質譜見圖2,克拉屈濱雜質的二級質譜圖見圖3。

圖3中雜質的[M+H]+峰m/z為170,為偶數(shù),屬于偶電子離子,應含奇數(shù)個氮,且離子豐度[M+1]+/ [M+2]+為3∶1,說明雜質中含一個氯原子,克拉屈濱的二級質譜中m/z 308為克拉屈濱的[M+Na]+峰, m/z 170是由[M+H]+中性丟失1分子2'-脫氧核苷產(chǎn)生的碎片離子1,根據(jù)質譜裂解規(guī)律,并通過高分辨質量數(shù)的確證(見表1),推斷出雜質為克拉屈濱C-N鍵斷裂后的腺苷結構,為2-氯腺嘌呤,形成和裂解途徑見圖4。

圖1 克拉屈濱注射液高效液相色譜圖

圖2 克拉屈濱不同能量下的二級質譜圖

圖3 克拉屈濱雜質不同能量下的二級質譜圖

圖4 克拉屈濱雜質的形成和裂解途徑

表1 克拉屈濱及其主要雜質的高分辨質譜數(shù)據(jù)

2.2.3 穩(wěn)定性分析 克拉屈濱注射液在不同pH, 4 500 lx光強,5%過氧化氫(H2O2)及60℃烘箱中放置5,10 d后的色譜分析結果見表2。由表2得知,克拉屈濱注射液在pH為6.5～8.0環(huán)境下最穩(wěn)定,酸性越強,越不穩(wěn)定;克拉屈濱易氧化,而受光照和溫度的影響較小。

表2 不同環(huán)境下雜質按歸一化法計算的百分含量

3 討論

克拉屈濱中雜質2-氯腺嘌呤在《美國藥典》[6]和《歐洲藥典》[7]均有收載,但考慮到國內外合成工藝可能有所不同及2-氯腺嘌呤對照品難以獲得,利用四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜高分辨率和高準確度的特點,能獲得待測物質的準確分子量,計算出可能的分子式,根據(jù)二級碎片裂解信息,結合合成工藝[8],推測出藥物雜質的分子結構,為藥物雜質鑒定提供一種快速、靈敏、準確的方法[9-10]。

穩(wěn)定性實驗可知,溶液酸度對克拉屈濱降解的影響較大,而現(xiàn)行標準中克拉屈濱注射液的pH范圍為5.5～7.5,建議定為更穩(wěn)定的pH范圍6.5～8.0。在氧化劑高的環(huán)境中,克拉屈濱分子中脫氧核苷與腺苷相連的C-N鍵容易斷裂,生成雜質2-氯腺嘌呤,因此克拉屈濱注射液中雜質2-氯腺嘌呤在原料藥得到有效控制的情況下,主要是因溶液pH偏低且有氧氣存在條件下降解產(chǎn)生,故在生產(chǎn)和儲存時應特別注意溶液pH控制和容器密封,必要時充氮,避免克拉屈濱降解。

[1] MICHAEL D M,TRICIA J.Determination of 2-chlorodeoxyadenosine(cladribine,2-CdA)in human plasma by liquid chromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry[J].JPharm Biomed Anal,1998,17:45-51.

[2] 藥品注冊的國際技術要求[S].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2007:99-126.

[3] 國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)[S].2005. YBH33322005.

[4] 胡昌勤.化學藥品雜質控制的現(xiàn)狀與展望[J].中國科學,2010,40(6):679-687.

[5] 張春燕,朱寶英,趙立波,等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定人血漿中氯法拉濱的濃度[J].中國藥學雜志, 2010,45(19):1497.

[6] United States Pharmacopeia-National Formulary(USP36NF-31)[S].2013.

[7] European Pharmacopoeia 7.0[S].2011:1707.

[8] 陳莉莉,岑均達.克拉屈濱的合成[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2005,36(7):387-389.

[9] 潘芳芳,朱培曦,黃巧巧,等.液相色譜-四極桿飛行時間質譜法分析頭孢拉定中的主要雜質[J].藥物分析雜志, 2013,33(1):133-137.

[10] 朱培曦,陳娟娟,李會林,等.液質聯(lián)用快速確定尼群地平原料藥中的雜質[J].藥物分析雜志,2012,32(1):88-92.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.029

R979.1;R927.2

A

1004-0781(2014)06-0794-03

2013-06-22

2013-07-20

楊麗珍(1990-),女,江西贛州人,碩士,研究方向:藥物分析與儀器分析。電話:(0)15868839451,E-mail:15807975068@163.com。

楊偉峰(1965-),男,主任藥師,碩士生導師,研究方向:藥物分析與儀器分析。電話:(0)13588175658,E-mail:ywfhz@163.com。