鄭為超，牛 凱，3，趙永見，張 雷，王擁軍

（1.安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032）

椎間盤退變（intervertebral disk degeneration，IVDD）是下腰痛的常見病因，其退變的分子機(jī)制極為復(fù)雜。白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)在退變的椎間盤中有著較高的活性［1］。其中炎癥因子IL-1β在椎間盤軟骨細(xì)胞退變的過程中起著非常重要的作用［2］。在椎間盤的組成中，軟骨終板是椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的重要部分，軟骨終板細(xì)胞的退變可加速椎間盤的退變，進(jìn)而引起一系列的椎間盤退變性疾病?？嘈尤受眨╝mygdalin）是傳統(tǒng)活血化瘀類中藥桃仁中的有效成分之一，廣泛存在于薔薇科植物的干燥成熟種子中［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［4－5］，其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)作用。因此，在本研究中我們采用IL-1β誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變，進(jìn)而觀察不同濃度的苦杏仁苷對退變大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的影響，并探尋可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 健康1月齡SD（Sprague-Dawley）大鼠SPF級購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實驗試劑 鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：H35020148），IL-1β粉劑（上海祥弘生物科技有限公司，100991-1 B0911），苦杏仁苷（amygdalin，050M7007V，美國 Sigma公司），胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco，USA），TRIzol（美國Sigma公司），TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司），多克隆兔抗Ⅱ型膠原抗體（武漢博士德生物工程有限公司，BA0533），熒光二抗、DAPI（KPL，美國），多聚甲醛、Tween-20、甲苯胺藍(lán)染液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），β-actin抗體（Sigma），Bax、Bcl-2抗體（Cell Signaling），蛋白裂解液、蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDSPAGE凝膠盒、酶標(biāo)二抗、BeyoECL Plus（碧云天），PVDF膜（NEN Life Science Products Inc公司）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天），碘化丙啶（BD公司），引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 實驗儀器 Forma-3111二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置相差光學(xué)顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司，BH-20型）；SANYO-MDF-J281AT超低溫冰箱；酶標(biāo)儀（Themo variol skant flash，USA）；紫外可見光分光光度計（DU800／VIS型，美國 Beckman公司）；熒光實時定量PCR儀（C1000 Thermal cycler型，新加坡）；基因R擴(kuò)增儀（Mastercycler Personal型，德國Eppendorf公司）；Eppendorf 5417R高速冷凍離心機(jī)（Eppendof公司）；流式細(xì)胞儀（BD Accuri C6，美國）；Leica熒光倒置顯微鏡（德國，DM3000B）；Western blot全套電泳轉(zhuǎn)膜儀（Chemi DcTM?MP Imaging System，Bio-rad）；Western blot顯色儀（Mini-PROTEAN Tetra System，Bio-rad）。

1.4 方法

1.4.1 大鼠椎間盤軟骨終板軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)我們從1月齡SD大鼠椎間盤軟骨終板分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。鹽酸氯胺酮注射液注入大鼠腹腔致死，在無菌條件下剪開大鼠背部皮膚，取出椎間盤，放入無菌的PBS中，去除表面的污漬，接著用剪刀將其附著組織清除，取軟骨終板，將其剪碎，用體積分?jǐn)?shù)為0.002的胰蛋白酶在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min。用體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），含 0.01青霉素／鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿置于CO2占0.05，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。每隔2 d更換一次0.1的FBS，取長至80%以上的3代軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.2 大鼠椎間盤軟骨終板軟骨細(xì)胞的鑒定 甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞。細(xì)胞爬片成功后，去培養(yǎng)液，用體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS沖洗3次，滴0.1%甲苯胺藍(lán)染色30 min，PBS沖洗數(shù)秒。另再用0.04的多聚甲醛固定15 min后，室溫消化（0.1%CaCl2＋0.1%Tripsion）10 min，PBS漂洗2次，0.01的BSA封閉30min，再加入0.01的BSA所稀釋的Ⅱ型膠原一抗（1∶200稀釋），4℃過夜。PBS漂洗2次，加入熒光二抗，37℃雜交1 h，PBS漂洗2次，鏡下觀察并照相記錄。

1.4.3 實驗分組 大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞長至80%后，更換無血清培養(yǎng)基，過夜。正常組用0.5%FBS的DMEM，IL-1β誘導(dǎo)組用體積分?jǐn)?shù)為0.005的 FBS、IL-1β濃度為10μg·L－1的 DMEM，給藥組用0.5%的 FBS、IL-1β濃度為 10μg·L－1、不同濃度苦杏仁苷的DMEM。如：流式分析細(xì)胞凋亡及PCR檢測基因表達(dá)，給藥組分為4個組，分別是苦杏仁苷 10－2、10－3、10－4、10－5mol·L－1給藥組。Western blot檢測苦杏仁苷10－4mol·L－1給藥組凋亡蛋白的表達(dá)。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測苦杏仁苷對大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞密度1萬個接種于12孔板，培養(yǎng)3 d后，更換無血清培養(yǎng)基，加藥，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液收集置于15 ml離心管，胰蛋白酶消化，終止反應(yīng)后，將其收集置于離心管，再用PBS清洗各孔，將清洗的PBS收集置于離心管，接著以1 500 r·min－1離心 5 min，棄上清，預(yù)冷 PBS重懸，棄上清，重復(fù)2次，用FITC結(jié)合液重懸，將重懸液移至1.5 ml離心管，避光加入FITC，30 min后加入 PI 5 min，接著上機(jī)檢測。

1.4.5 Real-time PCR檢測 Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)

1.4.5.1 細(xì)胞總 RNA提取 將 TRIzol液 1 ml加入6孔板中，吹混勻，加入氯仿 200μl，12 000 r·min－1，4℃離心15 min，接著取其上清液加入等體積預(yù)冷的異丙醇，12 000 r·min－1，4℃離心 10 min，加入0.1%，含0.75乙醇的 DEPC 1 ml混勻，清洗RNA沉淀，12 000 r·min－1，4℃離心 10 min，棄上清，用30μl無菌DEPC處理過的三蒸水溶解沉淀。1.4.5.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4.5.3 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系20μl，SYBR Premix Ex Taq 10μl，去離子水7μl，上下游引物各1μl，模板cDNA 1μl。反應(yīng)過程如下：95℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)，在95℃變性10 s，退火5 s，延伸1 min，循環(huán)次數(shù)均為40次。以β-actin作為內(nèi)參，將所得Ct值按照2－ΔΔCT的方法進(jìn)行處理。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence of RT-PCR

1.5 W estern blot 檢測給藥培養(yǎng)24 h后 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

1.5.1 蛋白樣品的處理 以每孔108·L－1的密度將細(xì)胞接種于6孔板中。待細(xì)胞長至80%，改用DMEM培養(yǎng)過夜（12～16 h），用藥處理24 h后，蛋白裂解液裂解細(xì)胞。蛋白濃度的測定按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒的說明進(jìn)行操作，使用全波長掃描多功能讀數(shù)儀測定蛋白濃度，先蛋白定量再計算各組體積，確保每個蛋白樣品的上樣量一致。按4∶1的比例加入5×上樣緩沖液混勻。沸水中蛋白變性10 min，冷卻后置于－20℃冰箱，待用。

1.5.2 Western blot檢測 配體積分?jǐn)?shù) 0.12的SDS-PAGE分離膠和0.05濃縮膠，灌膠凝固后，Marker 2μl，取 35μl（25μg）蛋白樣品，依次排序上樣，用恒壓80V電壓，電泳時間約30 min，具體時間應(yīng)根據(jù)蛋白Marker目的條帶分離的程度，然后將恒壓調(diào)至100V，繼續(xù)電泳，確定已將目的蛋白的條帶分開，停止電泳。按照轉(zhuǎn)膜夾陰極（黑色面）、一層海綿、2層濾紙、膠、膜、2層濾紙、一層海綿、轉(zhuǎn)膜夾陽極（白色面）的順序擺放好，并一層層趕走氣泡。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽，同時放入冰盒，倒入轉(zhuǎn)膜液，蓋好盒蓋后，置于冰盒中。恒流260mA轉(zhuǎn)膜60～90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜上所需目的蛋白的條帶切割下來，放入新配好的5%脫脂奶粉的封閉液中，做好標(biāo)記，置于搖床，搖晃1 h。1×TBS輕洗膜后，加入稀釋好的 β-actin（1∶1 000，鼠抗，一抗稀釋液配制），Bax、Bcl-2（1∶1 000，兔抗，一抗稀釋液配制），置于4℃冰箱過夜。1×TBST洗膜，根據(jù)一抗來源加入相應(yīng)稀釋好的酶標(biāo)二抗（1∶1 000，TBS配制），置于搖床上，30 r·min－11 h。接著清洗膜，TBST洗膜3次，每次10min。提前15min打開Bio-rad顯色儀，將膜放入顯色儀內(nèi)，進(jìn)行掃描顯色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以ˉx±s表示，各組間差異顯著性檢驗用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)鑒定 大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞呈梭形均勻生長。甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞基質(zhì)染成藍(lán)色，Ⅱ型膠原免疫熒光鑒定，細(xì)胞呈現(xiàn)綠色發(fā)光，如Fig 1所示。說明了培養(yǎng)的3代軟骨終板細(xì)胞維持了軟骨終板細(xì)胞原有的表型。

Fig 1 Identification of endplate chondrocytes（×200）A：Endplate chondrocytesby toluidine blue staining；B：The expression of Col2a1 in endplate chondrocytes by immunofluorescence

2.2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 流式分析結(jié)果示，正常組（Fig 2a）細(xì)胞凋亡比例為6.9%（早期凋亡比例與晚期凋亡比例之和），IL-1β誘導(dǎo)組（Fig 2b）細(xì)胞凋亡比例為 28.1%，苦杏仁苷 10－2mol·L－1（Fig 2c）凋亡比例為 22.2%，苦杏仁苷 10－3mol·L－1（Fig 2d）凋亡比例為 13.1%，苦杏仁苷 10－4mol·L－1（Fig 2e）凋亡比例為 8.5%，苦杏仁苷 10－5mol·L－1（Fig 2f）凋亡比例為 15.2%。誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡比例明顯高于正常組，苦杏仁苷各濃度給藥組細(xì)胞凋亡比例均低于誘導(dǎo)組，但都不同程度的高于正常組，苦杏仁苷10－4mol·L－1給藥組明顯下調(diào)細(xì)胞凋亡的比例。

Fig 2 Proportion of apoptosis assayed by flow cytometrya：Normal group；b：Induced group；c～f：Amygdalin 10－2 mol·L－1，10－3 mol·L－1，10－4 mol·L－1，10－5 mol·L－1

2.3 RT-PCR檢測Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá) 給藥培養(yǎng)24 h后，與正常組相比較，IL-1β誘導(dǎo)后，細(xì)胞BaxmRNA的表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA的表達(dá)降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？嘈尤受崭鳚舛冉M均有抑制IL-1β上調(diào)BaxmRNA的表達(dá)，作用強(qiáng)度不同，與誘導(dǎo)組相比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時苦杏仁苷各濃度組均有抑制IL-1β下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，與誘導(dǎo)組相比較，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩者均以苦杏仁苷 10－4mol·L－1濃度組作用效果最為明顯（Tab 2，F(xiàn)ig 3）。

Tab 2 Them RNA expression of Bax and Bcl-2±s，n＝3）

Tab 2 Them RNA expression of Bax and Bcl-2±s，n＝3）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs induced group

Group Bax Bcl-2 Normal group 1.00±0.05**1.00±0.06**Induced group 8.16±0.71 0.42±0.08 Amygdalin 10－2 mol·L－1 4.06±0.51** 0.59±0.06*10－3 mol·L－1 1.69±0.16** 0.68±0.02**10－4 mol·L－1 1.16±0.10** 0.95±0.07**10－5 mol·L－1 1.99±0.16** 0.61±0.03**

Fig 3 Effect of am ygdalin on m RNA expression of Bax and Bcl-2 in endplate chondrocytes induced by IL-1β*P＜0.05，**P＜0.01 vs induced group

2.4 W estern blot檢測 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示給藥培養(yǎng)24h后，誘導(dǎo)組Bax蛋白的表達(dá)量明顯高于其他組，苦杏仁苷10－4mol·L－1濃度組能明顯降低Bax蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯低于正常組，苦杏仁苷10－4mol·L－1濃度組能明顯上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)（Fig 4）。

Fig 4 Protein expression of Bax and Bcl-2

3 討論

椎間盤退變的過程中，自身存在的促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)著慢性炎癥的發(fā)生［6］，同時也伴隨著椎間盤細(xì)胞的凋亡。炎癥因子介導(dǎo)的反應(yīng)，加快了椎間盤細(xì)胞的壞死和凋亡，而細(xì)胞凋亡的增加是椎間盤退變發(fā)生和發(fā)展的重要因素［7－8］。細(xì)胞凋亡的過程伴隨著炎癥的發(fā)生，兩者之間的相互作用加速了椎間盤退變的進(jìn)程。前期的研究證明，IL-1β是椎間盤退變過程中一個非常關(guān)鍵的致炎細(xì)胞因子，能夠抑制軟骨終板細(xì)胞的活性，降低膠原的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶、各類炎癥因子的表達(dá)［9］。研究也證明了采用10mg·L－1的IL-1β培養(yǎng)椎間盤第3代軟骨終板細(xì)胞，能夠引起功能蛋白表達(dá)下降，炎癥相關(guān)酶類的表達(dá)升高，導(dǎo)致椎間盤軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變［10－12］。椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的過程中主要是線粒體的通路，Bax和Bcl-2基因是目前已知的在凋亡調(diào)控過程中功能相互對立的一對最重要的調(diào)控基因。正常情況下，這兩種蛋白的表達(dá)量相對穩(wěn)定，當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)時，啟動了凋亡，而當(dāng)Bcl-2超表達(dá)時，細(xì)胞存活延長［13－15］。

本研究中，我們采用10μg·L－1的 IL-1β誘導(dǎo)大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變，通過流式細(xì)胞分析儀分析軟骨終板細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠增加正常大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞的凋亡比例，苦杏仁苷各濃度組均可不同程度的減少細(xì)胞凋亡的比例。以苦杏仁苷10－4mol·L－1濃度組的作用明顯。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)組能夠明顯上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，同時下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，苦杏仁苷各濃度組能夠抑制IL-1β上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)，同時上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，以苦杏仁苷10－4mol·L－1濃度組的作用明顯。因此，進(jìn)一步采用Western blot檢測各組Bax、Bcl-2凋亡蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)組Bax蛋白的表達(dá)明顯增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，苦杏仁苷10－4mol·L－1濃度組能夠明顯下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。我們可以得出，IL-1β能夠通過改變Bax、Bcl-2在基因和蛋白水平上的表達(dá)，啟動和促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞的凋亡，從而加速椎間盤的退變，這與炎性介質(zhì)的表達(dá)也有著一定的關(guān)系，其具體的相互作用還不清楚?？嘈尤受湛梢砸种艻L-1β的這種作用，減少軟骨終板細(xì)胞的凋亡，延長軟骨終板細(xì)胞的生存周期。IL-1β促進(jìn)大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的作用及苦杏仁苷拮抗IL-1β促進(jìn)大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞凋亡的作用，可能是通過線粒體凋亡相關(guān)通路調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2的表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述：該研究表明苦杏仁苷作為活血化瘀類中藥桃仁中的有效成分，能夠拮抗炎癥因子IL-1β誘導(dǎo)和促進(jìn)椎間盤軟骨終板細(xì)胞的凋亡，苦杏仁苷的這種作用可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。我們可以通過抑制IL-1β對椎間盤軟骨終板細(xì)胞的作用，延緩椎間盤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而達(dá)到延緩椎間盤退變的目的?？嘈尤受漳軌蚱鸬窖泳徸甸g盤細(xì)胞的凋亡，延長椎間盤細(xì)胞的生存期，其具體作用的信號機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究［16－17］。

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